3.06 Tesis doctorado

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El ácido palmítico reduce la sensibilidad a insulina de neuronas hipotalámicas: rol de la autofagia y del receptor FFAR1/GPR40
(2022) Toledo Valenzuela, Lilian Alejandra; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La diabetes mellitus tipo 2 es una compleja enfermedad metabólica caracterizada por una hiperglicemia crónica, que puede ser debida a una disminución en la sensibilidad a la insulina, a una reducción en su secreción o una combinación de ambas. El consumo de una dieta alta en grasas, abundante en ácido palmítico, favorece el desarrollo de esta enfermedad. El ácido palmítico disminuye la sensibilidad a la insulina en todo el organismo, incluyendo las neuronas hipotalámicas, que inhiben la producción de glucosa hepática (PGH) clave en la regulación de la glicemia. La acumulación hipotalámica de ácido palmítico reduce la supresión de la PGH, lo cual podría causar una menor sensibilidad a insulina en estos animales; sin embargo, esto aún no ha sido dilucidado. Respecto al mecanismo, se ha descrito que la activación por ácido palmítico del Receptor de Ácidos Grasos Libres 1 FFAR1/GPR40, disminuye la respuesta a la insulina en células β-pancreáticas, aunque no se ha evaluado si también reduce la sensibilidad a insulina en neuronas hipotalámicas, y si esto se traduce en una menor captación de glucosa mediada por insulina. Por otra parte, hemos demostrado que la autofagia, un proceso de degradación y reciclaje esencial para la homeostasis celular, se inhibe por la activación de FFAR1/GPR40 por ácido palmítico en neuronas hipotalámicas. La inhibición de la autofagia se asocia con una menor sensibilidad a la insulina en diversas células, por lo que resulta relevante evaluar si su bloqueo por ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. En base a la evidencia expuesta previamente, este proyecto está enfocado en determinar si el ácido palmítico, a través del receptor de ácidos grasos libres 1 (FFAR1/GPR40) y por medio de la inhibición de la autofagia, reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. Por otro lado, queremos determinar si la infusión intracerebroventricular (ICV) de ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en ratones C57BL/6. Nuestros resultados muestran que el ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina de las neuronas hipotalámicas por un mecanismo que incluye tanto la activación de FFAR1/GPR40 como defectos en la autofagia, reduciendo la activación de la vía PI3K/AKT y disminuyendo la captación de glucosa inducida por insulina en neuronas hipotalámicas. Finalmente, nuestros datos sugieren que la infusión hipotalámica de ácido palmítico reduce la tolerancia a la glucosa y disminuye los niveles plasmáticos de insulina en ratones C57BL/6. Este proyecto provee nueva información acerca de cómo el ácido palmítico favorece el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2, dando énfasis en la función de FFAR1/GPR40 en las neuronas hipotalámicas y considerando a la autofagia como un mecanismo de regulación de la sensibilidad a insulina en estas células. Estos resultados podrían ser un precedente para futuros estudios enfocados en el rol de la autofagia en neuronas hipotalámicas y su relevancia en la regulación de la glicemia.
ADAM17 participa en la apoptosis fisiológica e inducida por xenoestrógenos durante la espermatogénesis
(2015) Urriola Muñoz, Paulina Andrea; Moreno Mauro, Ricardo D.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La apoptosis en células germinales es fundamental en la regulación de la producción diaria de espermatozoides, y se lleva a cabo tanto en condiciones fisiológicas como inducidas por agentes externos como lo son los genotóxicos, que dañan al DNA, y xenoestrógenos, que imitan a los estrógenos endógenos. Se sabe que los xenoestrógenos como Bisfenol A (BFA) y 4-Nonilfenol (NF) inducen un incremento del índice apoptótico en células de testículos de ratas y ratones y una baja producción de espermatozoides en estos animales. Sin embargo, el mecanismo que subyace a este efecto es desconocido. La ADAM17 (A Desintegrin And Metalloprotease-17) es una metaloproteasa de transmembrana relevante en la señalización paracrina/yuxtacrina y autocrina. En nuestro laboratorio se ha mostrado que la inhibición farmacológica de la ADAM17 disminuye la apoptosis de células germinales masculinas tanto en condiciones fisiológicas como en la inducida por drogas anticancerígenas y xenoestrógenos. Sin embargo, aún se desconoce si la presencia de la ADAM17 en las células germinales es fundamental en la apoptosis de estas células. Es por ello, se propuso la siguiente hipótesis: La presencia de ADAM17 es necesaria para la apoptosis de células germinales masculinas tanto fisiológica como inducida por los xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del ratón. En donde se plantearon 4 objetivos específicos: (1) Determinar la participación de la ADAM17 de las células germinales masculinas meióticas y post-meióticas sobre la apoptosis de estas células in vivo, (2) Evaluar la participación de la ADAM17 de las células germinales masculinas meióticas y postmeióticas sobre la apoptosis de estas células inducida por los xenoestrógenos BFA y NF in vivo, (3) Determinar el efecto de los xenoestrógenos BFA y NF sobre la actividad de la ADAM17 y (4) Estudiar in vitro la participación de la ADAM17 sobre la apoptosis inducida por BFA y NF en líneas celulares. Para esto, se creó un ratón knock out condicional para la ADAM17 en células germinales masculinas utilizando la tecnología Cre-LoxP. En estos ratones se observó que la apoptosis fisiológica e inducida por los xenoestrógenos BFA y NF disminuyó significativamente en relación a los silvestres cuando se evaluó el número de células caspasa-3 activa mediante inmunofluorescencia, el número de células picnóticas por tinción Pas-He, y el porcentaje de células TUNEL positivas. Usando estos ratones se estableció que la presencia de la ADAM17 es fundamental en la apoptosis de células germinales masculinas tanto en condiciones fisiológicas como inducida por BFA y NF. Además, se determinó la participación de esta metaloproteasa en el desarrollo de la espermatogénesis. Para ello, se calculó el porcentaje del peso testicular en comparación al peso corporal a los 21 y 60 días de edad, donde se observó una disminución significativa de este en ratones knock out respecto a los wild type. Esto puede ser explicado por la disminución en los parámetros histológicos del testículo, como la altura del epitelio, diámetro de los túbulos seminíferos y del lumen de los túbulos seminíferos observado en los ratones knock out respecto a los wild type. Por otro lado, para dilucidar si BFA y NF inducen actividad metaloproteasa de la ADAM17 (lo cual sería fundamental para la muerte de las células germinales) se creó un sistema in vitro en el cual se expresó una proteína que tiene el dominio intracelular, el de transmembrana y parte del dominio extracelular de 5 sustratos de la ADAM17 fueron fusionados con fosfatasa alcalina (FA). Estos sustratos son Neuregulina β1 (NRGβ1), Tumor Necrosis Factor α (TNFα), Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), Kit Ligand 2 (KitL2), o Transforming Growth Factor α (TGFα). Este sistema in vitro fue expresado en líneas celulares de células de Sertoli de ratón (TM4), en células de cáncer de próstata humana (LnCaP), o en células de fibroblasto de embrión de ratón (mEFs). De esta manera, se midió la liberación de fosfatasa alcalina al medio de cultivo (mediante la actividad de FA), lo que indirectamente refleja la actividad metaloproteasa de la ADAM17. Usando este sistema in vitro, se mostróque la inhibición farmacológica y/o genética (knockdown) de la ADAM17 previene la liberación de FA inducida por BFA o NF. Además, utilizando células mEFs que pierden iRhom1 y/o iRhom2 (proteínas inactivadas de la familia romboide) se determinó que la activación de ADAM17 inducida por BFA y NF depende de iRhom2 pero no de iRhom1. Por último, mediante los niveles proteicos del fragmento de 86 kDa de PARP (sustrato de caspasa-3) evaluados por western blot; el porcentaje de la población de células sub-G1 y de células Anexina V evaluadas por citometría de flujo se determinó que la inhibición genética de la ADAM17 previene la muerte celular inducida por BFA y NF. En conclusión la ADAM17 participa en la apoptosis de células germinales tanto fisiológica como inducida por los xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del ratón.
AMPA receptor stabilization mediated by non-canonical Wnt signaling protects against Aβ42 oligomers synaptotoxicity
(2018) Montecinos Oliva, Carla; Inestrosa Cantín, Nibaldo; Choquet, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los receptores AMPA (AMPARs) son los principales responsables de la respuesta excitatoria rápida en el sistema nervioso central, incluyendo neuronas hipocampales, estudiadas en esta tesis. A diferencia de otros receptores glutamatérgicos, los AMPARs son altamente dinámicos. Dentro de las espinas dendríticas, se pueden mover hacia y desde compartimentos endocíticos y hacia la membrana plasmática. Una vez en la superficie, a través de difusión lateral, se pueden anclar a proteínas de la densidad postsináptica o regresar a compartimentos endocíticos. Por otro lado, los oligómeros Aβ (oAβ) aumentan la endocitosis de AMPARs, disminuyen la densidad de espinas dendríticas y causan una falla generalizada de la transmisión sináptica excitatoria. Estos efectos, entre otros, se engloban en el término “sinaptotoxicidad por oAβ” y es uno de los principales puntos de estudio en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Al contrario, Wnt5a un ligando endógeno conocido por activar la víano canónica en neuronas hipocampales, genera un aumento en corrientes excitatorias y en losclusters de PSD95 y protege a las neuronas contra la sinaptotoxicidad causada por oAβ. Debido a esto, procedimos a estudiar el mecanismo por el cual Wnt5a protege de la sinaptotoxicidad causada por Aβ. Esto nos llevó a evaluar los efectos de Wnt5a en uno de los principales factores en la transmisión glutamatérgica, la dinámica de los AMPARs. Con el uso de microscopía de super-resolución en neuronas hipocampales vivas, encontramos que Wnt5a modula la dinámica y localización de los AMPARs. Específicamente, Wnt5a estabiliza los AMPARs en espinas y dendritas. Lo cual se correlaciona con un aumento en la co-localización e interacción entre GluA2 y PSD95. Estos efectos son causados únicamente por la activación no-canónica de la vía Wnt, a través del ligando Wnt5a y no por los efectos canónicos de Wnt7a. De manera interesante, la pre-incubación de Wnt5a previene la toxicicidad de los oligómeros Aβ y mantiene la dinámica basal de los AMPARs. Esta data sugiere que Wnt5a promueve la estabilización de AMPARs, previniendo los efectos synaptotóxicos de los oAβ.
Análisis de los cambios tempranos del transcriptoma en respuesta al daño en la médula espinal de Xenopus laevis.
(2019) Peñailillo Lazo, Johany Freddy; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
A diferencia de los mamíferos, otros animales como las larvas de anfibios anuros (donde se incluye a Xenopus) pueden lograr una recuperación funcional completa después de una lesión en la médula espinal. En nuestro laboratorio, se ha establecido a la rana Xenopus laevis (X. laevis) como un organismo modelo para estudiar la regeneración de la médula espinal. Una de las principales ventajas de X. laevis es que las larvas en etapas 50-54 (estadios-R) pueden recuperarse anatómica, histológica y funcionalmente después de una lesión en la médula espinal (LME). Esas habilidades se pierden por completo en las ranas juveniles (estadio-NR). La zona ependimaria del canal central de la médula espinal de las larvas en estadios-R presenta un alto porcentaje de células progenitoras neuronales (NPC) Sox2+. Estas se activan rápidamente en respuesta a una lesión y son necesarias para lograr la regeneración completa de la médula espinal. Nuestro interés es identificar las redes genéticas y las vías de señalización involucradas en la activación temprana de NPC. Para identificar los mecanismos y las vías de señalización involucradas en la activación de células Sox2+, hemos realizado un análisis de los cambios del transcriptoma durante las primeras 21 horas posteriores a la transección (hpt) en animales en estadios-R. Con este objetivo, el tejido del sitio de la lesión se aisló cada 1 hora luego de la lesión en animales transectados, así como también en animales control, con daño simulado (sham) y sin daño. Como resultado de este muestreo y posterior secuenciación de ARNm conseguimos más de 100 librerías de RNA-seq, con las cuales se realizó un exhaustivo análisis bioinformático. Los genes expresados diferencialmente (GEDs) se identificaron mediante Procesos Gaussianos. Posteriormente, la estructura modular de los GEDs se infirió utilizando un Análisis de redes de Co-expresión Génica Ponderada (WGCNA). Estos módulos de co-expresión fueron analizados buscando procesos biológicos y vías de señalización KEGG enriquecidas. Además, analizamos los motivos de unión al ADN de factor de transcripción enriquecidos en el promotor proximal de genes coexpresados y las interacciones proteína-proteína entre los GEDs. Identificamos 1850 GEDs que se agruparon en 11 módulos de coexpresión (3 regulados negativamente, 2 regulados positivamente con una activación inmediata, 3 regulados positivamente con una activación intermedia y 3 regulados positivamente con una activación tardía). El análisis de ontología génica reportó: (1) un enriquecimiento de los reguladores negativos de la señalización mTOR en los primeros módulos regulados negativamente, (2) un aumento en factores de transcripción en los módulos de activación inmediata, (3) un aumento en los componentes de la biogénesis del ribosoma en módulos de activación intermedia y (4) un aumento en genes asociados a división de células progenitoras y de ciclo celular en módulos de activación tardía. En base a nuestros análisis bioinformáticos decidimos estudiar el rol de la vía mTOR durante las primeras horas luego de la transección. Análisis por Western Blot e Inmunofluorescencia contra p-S6, la forma activa de un componente intracelular de la vía mTOR, mostraron una activación rápida a las 3 hpt y principalmente en las células de la zona ependimaria del canal central cercanas al sitio de la lesión y los cuerpos neuronales a lo largo del sistema nervioso. La inhibición de esta vía de señalización utilizando rapamicina bloquea la proliferación de células Sox2+ y la recuperación funcional después de la LME. Estos resultados sugieren un papel clave para la vía mTOR en la rápida activación de las células Sox2+ para una adecuada recuperación después de la LME en renacuajos. De esta manera, podemos concluir que identificamos cambios tempranos en el transcriptoma de la médula espinal en respuesta al daño a la médula espinal, los cuales pueden ser asociados a varios procesos biológicos y vías de señalización que se despliegan en ondas transcripcionales secuenciales después de la LME. Finalmente, análisis bioinformáticos y pruebas funcionales de la vía mTOR sugieren que esta vía de señalización sería clave durante las primeras horas de la regeneración de la médula espinal.
Aumento de proliferación y neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis en respuesta a la sobre expresión de Lin28
(2022) Herrera Rojas, Mauricio Alejandro; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En humanos un daño a la médula espinal se considera irreversible, sin embargo, existen animales con alta capacidad regenerativa tales como el pez cebra, el ajolote y la rana Xenopus laevis los cuales son capaces de regenerar la médula espinal después de un daño, recuperando las conexiones y movilidad perdida producto de la lesión. Para el estudio de la regeneración de la médula espinal, Xenopus laevis presenta ventajas que lo hacen un modelo único de estudio. En etapas pre-metamórficas es un animal con la capacidad de regenerar la médula, mientras que durante y después de la metamorfosis, este animal pierde esas capacidades, por lo que se transforma en un animal no regenerativo. Estudios de nuestro laboratorio utilizando a Xenopus laevissugieren que, para que ocurra regeneración de la médula espinal en estadios regenerativos, es necesario la activación de progenitores neurales identificados como células Sox2+. Al analizar los niveles de expresión de Sox2, se ha visto que estos disminuyen a medida que la rana avanza el desarrollo (metamorfosis). Por lo tanto, se determinó que la disminución de Sox2, podría ser una causa del porqué la rana pierde las capacidades regenerativas en estadios pre-metamórficos. La pregunta que surge en cuestión es ¿existe algún factor que pueda regular a los progenitores neurales Sox2+ y promover la neurogénesis para la regeneración de la médula espinal? Cimadamore en el 2013 demostró que la sobre expresión exógena de la proteína de unión a RNA Lin28 era suficiente para rescatar a los progenitores neuronales de un defecto proliferativo en los estadios más tempranos de la neurogénesis, asociados a la pérdida de Sox2. En el mismo año, el grupo de Shyh-Chang demostró que se mejoraba la regeneración acelerando el recrecimiento de cartílagos, huesos y tejido mesenquimal después de la amputación de los dígitos distales o la perforación de las orejas en los animales. Por último, una expresión constitutiva de Lin28 en células P19, causó un bloqueo completo de glicogénesis acompañado de un incremento en la neurogénesis. Estos antecedentes nos hacen pensar Lin28 podría ser un factor preponderante para inducir la regeneración en la médula espinal mediante la regulación de los progenitores neurales Sox2+. En base a esto, nosotros presentamos la siguiente hipótesis: La sobre expresión de Lin28 produce un aumento de proliferación celular y de la neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis. Nuestros resultados muestran que hay un aumento significativo de la proliferación de progenitores Sox2 en la médula espinal de la rana producto del daño y que a través de los métodos clásicos de estudio de la neurogénesis con la utilización de un marcador de neurona madura NeuN, se observó que existe neurogénesis en respuesta al daño en estadios regenerativos de Xenopus laevis, por lo tanto, la neurogénesis podría ser un posible mecanismo por el cual la rana puede regenerar la médula espinal después de una daño. Además, los ensayos de sobre expresión de Lin28a en estadios regenerativos demostraron que esta proteína de unión a RNA, regularía la proliferación celular aumentando la actividad de las células progenitoras e induciría la diferenciación celular hacia un fenotipo neuronal generando un aumento en la neurogénesis en la médula espinal en ausencia de daño. Por lo tanto, nosotros creemos Lin28a sería un buen candidato de estudio para la regeneración de la médula espinal de Xenopus laevis a través del aumento de la neurogénesis.
C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
(2014) González Zúñiga, Marcelo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
Cancer, an ecological manifesto of metazoan life : the multi-scale ecology of complex cancer ecosystems.
(2020) Castillo, Simón P.; Marquet, P. A. (Pablo A.); Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Mas allá de ser una enfermedad exclusiva de los genes, el cáncer exhibe una estrecha relación con el ambiente biofísico, lo que lo constituye como un fenómeno ecológico. Esta tesis se enfoca en el estudio del cáncer bajo aproximaciones teóricas, analíticas, y experimentales bajo una mirada ecológica; aplicada desde la emergencia del cáncer (oncogénesis) hasta la migración de propágulos metastáticos entre órganos. En el primer capítulo, trabajamos en una conceptualización de la oncogénesis como un cambio en el fenotipo celular en respuesta al envejecimiento del organismo. Proponemos que en respuesta a los cambios en el ambiente celular que ocurren durante el envejecimiento no se mantiene el contexto bajo el cual se mantiene la multicelularidad traduciéndose en un cambio fenotípico celular que se aproxima a condiciones atávicas ‘unicelulares’ de disgregación estructural y funcional. Discutimos acerca de las nociones de individualidad, co-determinación individuo-ambiente y la enacción. El envejecimiento participa en la determinación de los rasgos de historia de vida celulares; y por lo tanto, las interacciones entre distintos tipos celulares. En el segundo capítulo abordamos la complejidad de interacciones competitivas entre estrategias celulares, cancerosas y no-cancerosas, y el ambiente físico. Desarrollamos un modelo analítico a partir de observaciones de competencia en un modelo in vitro (línea HEY-GFP de cáncer de ovario y línea MET5A de mesotelio de ovario) en condiciones de cultivo asociadas al envejecimiento del tejido ovárico (Matrigel con concentración variable de colágeno I). Nuestros modelos proponen que mecanismos competitivos jerárquicos influenciados por el envejecimiento modularían las ventajas competitivas de las células no-cancerosas; permitiendo que en tales ambientes la estrategia cancerosa logre invadir el ecosistema residente. En el tercer capítulo, abordamos la dimensión espacial el fenómeno a partir del estudio de la estructura espacial de los ecosistemas de cáncer mamario (ER+DCIS) bajo terapia endocrina neoadyuvante anti-proliferativa (ensayo clínico fase III POETIC, UK). Utilizando algoritmos supervisados de machine learning identificamos de forma automatizada células individuales en muestras de tumor con tinción inmunohistoquímica Ki67 (marcador de proliferación). Identificamos zonas de mayor concentración celular (hotspots) y proyectamos las células en tales hotspots como nodos de una red espacialmente explícita. La detección y cuantificación de la comunidad espacialmente estructurada y fragmentada de células cancerosas y del sistema inmune junto con la expresión de Ki67, permite predecir con mayor poder la respuesta patológica a terapia anti-proliferativa. Además de operar como articulador de patrones espaciales, la diversidad de historias de vida celular, en interacción con las condiciones locales del ambiente celular, modulan la probabilidad de que células tumorales puedan invadir otros órganos. En el último capítulo, basados en registros recopilados de literatura, cuantificamosla invasibilidad y la variabilidad en invasividad de canceres metastásicos y analizamos el patrón emergente de tal variabilidad. A través del análisis de la metástasis como una red entre órganos fuente y receptores, un gradiente de invasividad e invasibilidad subyace el patrón macroscópico que resulta ser modular, anidado y libre de escala. Discutimos algunos mecanismos relacionados al gradiente de invasibilidad y la invasividad dando cuenta de la estructura global de la red. El trabajo desarrollado en esta tesis evidencia que el pensamiento ecológico y su aplicabilidad está más allá del paradigma ecológico tradicional, y que, por lo tanto, una visión multiescala del cáncer inspirado por relaciones entrelazadas en la naturaleza, podría dar luces de los mecanismos que subyacen la evolución del cáncer en el contexto del programa de organización multicelular, con las implicancias ecológicas, evolutivas y clínicas que ello contiene.Mas allá de ser una enfermedad exclusiva de los genes, el cáncer exhibe una estrecha relación con el ambiente biofísico, lo que lo constituye como un fenómeno ecológico. Esta tesis se enfoca en el estudio del cáncer bajo aproximaciones teóricas, analíticas, y experimentales bajo una mirada ecológica; aplicada desde la emergencia del cáncer (oncogénesis) hasta la migración de propágulos metastáticos entre órganos. En el primer capítulo, trabajamos en una conceptualización de la oncogénesis como un cambio en el fenotipo celular en respuesta al envejecimiento del organismo. Proponemos que en respuesta a los cambios en el ambiente celular que ocurren durante el envejecimiento no se mantiene el contexto bajo el cual se mantiene la multicelularidad traduciéndose en un cambio fenotípico celular que se aproxima a condiciones atávicas ‘unicelulares’ de disgregación estructural y funcional. Discutimos acerca de las nociones de individualidad, co-determinación individuo-ambiente y la enacción. El envejecimiento participa en la determinación de los rasgos de historia de vida celulares; y por lo tanto, las interacciones entre distintos tipos celulares. En el segundo capítulo abordamos la complejidad de interacciones competitivas entre estrategias celulares, cancerosas y no-cancerosas, y el ambiente físico. Desarrollamos un modelo analítico a partir de observaciones de competencia en un modelo in vitro (línea HEY-GFP de cáncer de ovario y línea MET5A de mesotelio de ovario) en condiciones de cultivo asociadas al envejecimiento del tejido ovárico (Matrigel con concentración variable de colágeno I). Nuestros modelos proponen que mecanismos competitivos jerárquicos influenciados por el envejecimiento modularían las ventajas competitivas de las células no-cancerosas; permitiendo que en tales ambientes la estrategia cancerosa logre invadir el ecosistema residente. En el tercer capítulo, abordamos la dimensión espacial el fenómeno a partir del estudio de la estructura espacial de los ecosistemas de cáncer mamario (ER+DCIS) bajo terapia endocrina neoadyuvante anti-proliferativa (ensayo clínico fase III POETIC, UK). Utilizando algoritmos supervisados de machine learning identificamos de forma automatizada células individuales en muestras de tumor con tinción inmunohistoquímica Ki67 (marcador de proliferación). Identificamos zonas de mayor concentración celular (hotspots) y proyectamos las células en tales hotspots como nodos de una red espacialmente explícita. La detección y cuantificación de la comunidad espacialmente estructurada y fragmentada de células cancerosas y del sistema inmune junto con la expresión de Ki67, permite predecir con mayor poder la respuesta patológica a terapia anti-proliferativa. Además de operar como articulador de patrones espaciales, la diversidad de historias de vida celular, en interacción con las condiciones locales del ambiente celular, modulan la probabilidad de que células tumorales puedan invadir otros órganos. En el último capítulo, basados en registros recopilados de literatura, cuantificamosla invasibilidad y la variabilidad en invasividad de canceres metastásicos y analizamos el patrón emergente de tal variabilidad. A través del análisis de la metástasis como una red entre órganos fuente y receptores, un gradiente de invasividad e invasibilidad subyace el patrón macroscópico que resulta ser modular, anidado y libre de escala. Discutimos algunos mecanismos relacionados al gradiente de invasibilidad y la invasividad dando cuenta de la estructura global de la red. El trabajo desarrollado en esta tesis evidencia que el pensamiento ecológico y su aplicabilidad está más allá del paradigma ecológico tradicional, y que, por lo tanto, una visión multiescala del cáncer inspirado por relaciones entrelazadas en la naturaleza, podría dar luces de los mecanismos que subyacen la evolución del cáncer en el contexto del programa de organización multicelular, con las implicancias ecológicas, evolutivas y clínicas que ello contiene.Mas allá de ser una enfermedad exclusiva de los genes, el cáncer exhibe una estrecha relación con el ambiente biofísico, lo que lo constituye como un fenómeno ecológico. Esta tesis se enfoca en el estudio del cáncer bajo aproximaciones teóricas, analíticas, y experimentales bajo una mirada ecológica; aplicada desde la emergencia del cáncer (oncogénesis) hasta la migración de propágulos metastáticos entre órganos. En el primer capítulo, trabajamos en una conceptualización de la oncogénesis como un cambio en el fenotipo celular en respuesta al envejecimiento del organismo. Proponemos que en respuesta a los cambios en el ambiente celular que ocurren durante el envejecimiento no se mantiene el contexto bajo el cual se mantiene la multicelularidad traduciéndose en un cambio fenotípico celular que se aproxima a condiciones atávicas ‘unicelulares’ de disgregación estructural y funcional. Discutimos acerca de las nociones de individualidad, co-determinación individuo-ambiente y la enacción. El envejecimiento participa en la determinación de los rasgos de historia de vida celulares; y por lo tanto, las interacciones entre distintos tipos celulares. En el segundo capítulo abordamos la complejidad de interacciones competitivas entre estrategias celulares, cancerosas y no-cancerosas, y el ambiente físico. Desarrollamos un modelo analítico a partir de observaciones de competencia en un modelo in vitro (línea HEY-GFP de cáncer de ovario y línea MET5A de mesotelio de ovario) en condiciones de cultivo asociadas al envejecimiento del tejido ovárico (Matrigel con concentración variable de colágeno I). Nuestros modelos proponen que mecanismos competitivos jerárquicos influenciados por el envejecimiento modularían las ventajas competitivas de las células no-cancerosas; permitiendo que en tales ambientes la estrategia cancerosa logre invadir el ecosistema residente. En el tercer capítulo, abordamos la dimensión espacial el fenómeno a partir del estudio de la estructura espacial de los ecosistemas de cáncer mamario (ER+DCIS) bajo terapia endocrina neoadyuvante anti-proliferativa (ensayo clínico fase III POETIC, UK). Utilizando algoritmos supervisados de machine learning identificamos de forma automatizada células individuales en muestras de tumor con tinción inmunohistoquímica Ki67 (marcador de proliferación). Identificamos zonas de mayor concentración celular (hotspots) y proyectamos las células en tales hotspots como nodos de una red espacialmente explícita. La detección y cuantificación de la comunidad espacialmente estructurada y fragmentada de células cancerosas y del sistema inmune junto con la expresión de Ki67, permite predecir con mayor poder la respuesta patológica a terapia anti-proliferativa. Además de operar como articulador de patrones espaciales, la diversidad de historias de vida celular, en interacción con las condiciones locales del ambiente celular, modulan la probabilidad de que células tumorales puedan invadir otros órganos. En el último capítulo, basados en registros recopilados de literatura, cuantificamosla invasibilidad y la variabilidad en invasividad de canceres metastásicos y analizamos el patrón emergente de tal variabilidad. A través del análisis de la metástasis como una red entre órganos fuente y receptores, un gradiente de invasividad e invasibilidad subyace el patrón macroscópico que resulta ser modular, anidado y libre de escala. Discutimos algunos mecanismos relacionados al gradiente de invasibilidad y la invasividad dando cuenta de la estructura global de la red. El trabajo desarrollado en esta tesis evidencia que el pensamiento ecológico y su aplicabilidad está más allá del paradigma ecológico tradicional, y que, por lo tanto, una visión multiescala del cáncer inspirado por relaciones entrelazadas en la naturaleza, podría dar luces de los mecanismos que subyacen la evolución del cáncer en el contexto del programa de organización multicelular, con las implicancias ecológicas, evolutivas y clínicas que ello contiene.
“Characterization of the effects induced by ADAR1 over long non-coding RNAs A-to-I editing and expression levels in breast cancer”
(2020) Rojas de Santiago, Pamela Roxana; Armisén Yáñez, Ricardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La enzima Adenosina desaminasa que actúa sobre ARNs 1 (ADAR1, del inglés Adenosine deaminase acting on RNAs 1) ha sido ampliamente descrita como un factor modulador de la edición, niveles de expresión y función de sus ARNs blancos, pudiendo ser estos codificantes y no-codificantes. Entre los últimos, los ARNs largos no-codificantes (lncRNAs, del inglés long non-coding RNAs) (> 200 nt de largo) se han destacado por ser componentes centrales en procesos celulares tanto fisiológicos como patológicos. En cáncer de mama, ambos ADAR1 y lncRNAs, han sido caracterizados como elementos clave en vías de señalización oncogénicas y supresoras de tumores. Sin embargo, sólo unos pocos reportes en la literatura abordan la relación ADAR1-lncRNAs, quedando mucho por entender a escala transcriptómica. Por este motivo, esta tesis está enfocada principalmente en abordar los efectos inducidos por ADAR1 tanto en los niveles de expresión como en la edición de lncRNAs y cómo esto podría estar relacionado a la progresión del cáncer. Mediante el uso de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq), detectamos que ADAR1 puede modular la expresión de varios lncRNAs, encontrando que el RNA 944 intergénico largo no codificante (LINC00944) respondía de forma consistente a la ganancia y pérdida de función de ADAR1. Al analizar los datos de pacientes de la cohorte de cáncer de mama de The Cancer Genome Atlas (TCGA-BRCA), encontramos que bajos niveles de LINC00944 se correlacionan con fenotipos malignos, como una fracción menor de infiltración linfocitaria en el microambiente tumoral (TILs, del inglés tumor-infiltrating lymphocytes) y con una disminución en la expresión de marcadores pro-apoptóticos. En la misma línea, encontramos que una baja expresión de LINC00944 se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes, ya que la disminución en su expresión se correlacionó con una reducción en la supervivencia general y supervivencia libre de recaídas. La sobreexpresión de ADAR1 se ha asociado a un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama triple-negativo (TNBC, del inglés triple-negative breast cancer). Al analizar la cohorte de TCGA-BRCA, demostramos que ADAR1 induce la edición A-por-I en aproximadamente el 10% de los lncRNA expresados en tumores TNBC. Asimismo, encontramos que éstos transcritos fueron editados en una alta proporción. En la presente tesis, nosotros ilustramos dos ejemplos de cómo la edición A-por-I podría estar alterando la función de lncRNAs: ya que PVT1 presentó el mayor número de posiciones editadas, hipotetizamos que su función de lncRNA esponja está siendo diversificada por la edición A-por-I y de esta forma permitiendo la progresión del cáncer. Por otro lado, planteamos la hipótesis de que la capacidad de PINK1-AS1 para estabilizar su ARNm sentido PINK1, puede verse alterada mediante la edición del lncRNA en tumores TNBC y que, en este contexto, podría ser maligna.
Coagulation factor Xa promotes metastasis through endothelial cell activation
(2019) Arce Arata, Maximiliano Amadeo; Owen, Gareth Ivor; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Diversos estudios han demostrado una alta asociación entre hipercoagulabilidad sanguínea y la progresión del cáncer. La principal consecuencia de esta asociación es el desarrollo de cuadros de trombosis venosa, la cual es la segunda causa de muerte en pacientes oncológicos. Sin embargo, se desconocen ciertos mecanismos asociados al efecto de la vía de coagulación en diversos aspectos relacionados a la progresión del cáncer. Por lo tanto, analizamos el efecto del factor de coagulación Xa (FXa), una proteína central de la vía de coagulación, sobre el crecimiento tumoral y en la metástasis experimental de células de cáncer. El tratamiento intravenoso con FXa aumentó el crecimiento tumoral y la metástasis de células de melanoma murino (B16F10) al hígado, riñón y ganglios linfáticos. Tras la administración concomitante del anticoagulante anti-FXa Dalteparina, la metástasis pulmonar se redujo significativamente y no se observó metástasis en otros órganos. FXa no alteró directamente la proliferación, migración o invasión de células cancerosas in vitro. Por otro lado, FXa aumentó la formación de fibras de estrés, promoviendo así la disrupción de la VEcadherina en la membrana y en consecuencia un aumento en la permeabilidad endotelial. Adicionalmente, células endoteliales tratadas con FXa mostraron un aumento en las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1, lo cual promovió la adhesión de células B16F10. Un análisis realizado mediante un Microarray demostró que células endoteliales tratadas con FXa expresaron mayores niveles de transcritos inflamatorios en comparación al control, lo cual se relacionó con un incremento en la infiltración de células inmunes en los pulmones de ratones tratados con FXa. En conjunto, nuestros resultados sugieren que FXa incrementa la metástasis de células B16F10 a través de la activación de células endoteliales, lo cual apoya el concepto de que el sistema de coagulación no es simplemente un espectador en el proceso de metástasis del cáncer.
Contribution of Fc gamma receptors to the pathology induced by human metapneumovirus in a murine model
(2020) Acevedo Acevedo, Orlando Andrés; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El Metapneumovirus humano (MPVh) es una de las principales causas de infecciones graves de las vías respiratorias inferiores y de hospitalización en niños menores de cinco años. La evidencia clínica indica que estos casos graves de infección por MPVh se acompañan de una infiltración masiva de neutrófilos orquestada por la acción coordinada de macrófagos y células dendríticas (CDs). Sin embargo, los mecanismos que regulan esta respuesta inflamatoria siguen siendo poco conocidos. Las evidencias de otros estudios destacan el papel de los receptores de la porción Fc de la inmunoglobulina G (FcγRs) en la modulación de la función y el reclutamiento de las CDs, así como de los macrófagos y neutrófilos durante la inflamación. Como parte de la tesis doctoral, investigamos el papel del receptor de IgG murino canónicamente inhibidor FcγRIIb y canónicamente activador FcγRIII en la respuesta de neutrófilos desencadenada por la infección por MPVh. Además, también determinamos si la falta de tales receptores regula la infiltración de macrófagos y CDs que, además de los neutrófilos, orquestan la respuesta innata frente al MPVh. Utilizando neutrófilos purificados, también examinamos el papel putativo del MPVh y del MPVh opsonizado con IgG en la forma de inmuno-complejos de MPVh (MPVh-ICs) en la regulación de la expresión de ambos receptores, que a su vez pueden modular la función de los neutrófilos en un contexto in vivo. Con una estrategia similar, también determinamos si estos estímulos regulan la apoptosis de los neutrófilos, la producción de especies reactivas de oxígeno (EROS), así como la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (TENs), que en conjunto pueden contribuir a una mayor inflamación de las vías respiratorias después de la infección por MPVh. Los resultados de este estudio indican que la infección por MPVh produce daño pulmonar, evidenciado como un aumento de la puntuación de histopatología pulmonar en ratones WT en comparación con controles no infectados, que no se observó en ratones FcγRIIb- /- y ratones FcγRIII - /- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen a la inflamación desencadenada por MPVh en los pulmones. Además, la infección por MPVh aumenta el número medio de neutrófilos viables en las vías respiratorias y pulmones de ratones WT, pero no en ratones FcγRIIb -/- y FcγRIII-/- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen al reclutamiento de neutrófilos y después de la infección por MPVh. Además, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII atenúa el incremento de Macrófagos intersticiales (MIs) en el pulmón y lavado broncoalveolar de ratones WT luego de la infección con MPVh los cuales en conjunto con los neutrófilos podría contribuir a la obstrucción de las vías respiratorias durante la infección. En contraste, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII evita la reducción en los niveles de Macrófagos Alveolares (MAs) viables que se observa después de la infección de ratones WT y que de acuerdo con estudios previos podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos en las vías aéreas y el tejido pulmonar. Por otro lado, también demostramos que el MPVh opsonizado con IgG y el MPVh por si solo previenen la apoptosis constitutiva de neutrófilos purificados los que a su vez desencadenan la producción de EROS y TENs que en conjunto pueden contribuir al daño pulmonar producida por la infección de MPVh. En conclusión, nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la interacción entre FcγRs específicos y MPVh opsonizado con IgG podría usarse como una nueva estrategia terapéutica para prevenir la respuesta inflamatoria pulmonar contra este virus. En este contexto, el uso de anticuerpos monoclonales con porciones Fc modificadas y que reconozcan proteínas de superficie de MPVh, que pueden activar FcγRs distintos de FcγRIIb y FcγRIII, podría usarse como tratamientos profilácticos o terapéuticos novedosos para disminuir la inflamación pulmonar causada por la infección con MPVh.
Control del acoplamiento neurovascular a través de la regulación de los hemicanales formados por conexinas o panexinas por la producción de óxido nítrico en los astrocitos
(2018) Puebla Catalán, Mariela del Carmen; Figueroa, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El acoplamiento neurovascular es un mecanismo complejo que relaciona los cambios en la actividad neuronal con el subsecuente cambio en el flujo sanguíneo cerebral local, de manera de asegurar el aporte de nutrientes y oxígeno, proporcional al aumento de la actividad neuronal. De este modo, la función integrada que surge de la comunicación entre una red de múltiples tipos celulares como son neuronas, astrocitos y células vasculares, representa una unidad funcional denominada “unidad neurovascular”. La actividad neuronal es codificada en los astrocitos en forma de ondas de calcio (Ca2+) intracelular, que se inician principalmente tras la activación de los receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR), y que se propagan hasta los procesos astrocíticos que están en una estrecha relación con las arteriolas cerebrales. La propagación interastrocítica de las ondas de Ca2+ es mediada por uniones en hendidura, pero además por la liberación de Adenosin-trifosfato (ATP)y la consiguiente estimulación de receptores purinérgicos. Así, se ha planteado que la liberación de ATP a través de hemicanales formados por conexina-43 (Cx43) o canales formados por panexina-1 (Panx-1) expresados en los astrocitos, podrían participar en la coordinación de las ondas de Ca2+ entre los astrocitos. Sin embargo, el rol de estos canales en la señalización de Ca2+ observada en los astrocitos durante el acoplamiento neurovascular no está claro. Por otra parte,existen unos pocos trabajos que muestran la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) en los astrocitos, por lo que estas células podrían producir óxido nítrico (NO). En este contexto, se ha documentado que el NO induce la apertura de hemicanales formados por Cx43 por directa S-nitrosilación, mientras que la regulación vía NO de la apertura de canales formados por Panx1 es controversial; sin embargo, no está descrito si el NO producido por los astrocitos participa en la modulación de la apertura de estos canales en el acoplamiento neurovascular. Además, se ha descrito la existencia de un canal que posee similitudes estructurales con hemicanales formados por conexinas y canales formados por panexinas, el calcium homeostasis modulator 1(CALHM1), el cual se ha documentado que participa en la liberación de ATP, pero no se ha estudiado si este canal puede ser modulado por NO, así como tampoco si participa en los mecanismos asociados al acoplamiento neurovascular. Con estos antecedentes, se propuso que la apertura de los hemicanales formados por Cx43 y/o canales formados por Panx-1 a través del NO producido por los astrocitos, contribuye al acoplamiento neurovascular por medio de la liberación de ATP. Los objetivos generales planteados fueron: 1) determinar si el NO producido por los astrocitos participa en el acoplamiento neurovascular; 2) evaluar si la activación de los receptores metabotrópicos de glutamato induce la apertura de hemicanales formados por Cx43y/o canales formados por Panx-1 a través de la producción de NO en los astrocitos; 3) determinar si la liberación de ATP a través de hemicanales formados por Cx43 y/o canales formados porPanx-1 participa en el acoplamiento neurovascular. Estos objetivos se desarrollaron principalmente en cultivos primarios de astrocitos y rebanadas de cerebro de rata, encontrándose que la vasodilatación de las arteriolas parenquimales cerebrales inducida por la activación de mGluR depende del aumento en la producción de NO en los astrocitos. Además, la activación de mGluR en los astrocitos indujo un aumento en la apertura de los hemicanales formados por Cx43 y canales formados por Panx-1, mientras que las ondas de Ca2+, generadas tras la activación de mGluR, fueron inhibidas por el bloqueo de estos canales, así como también por el bloqueo de los receptores purinérgicos. Sin embargo, el bloqueo de los hemicanales formados por Cx43 o canales formados por Panx-1 no abolió la liberación de ATP. Adicionalmente, se determinó por primera vez que CALHM1 se expresa en astrocitos y que la activación de mGluR produce la apertura de CALHM1, dependiente de su S-nitrosilación, siendo esta la vía de liberación de ATP. Estos resultados indican que la apertura de CALHM1 vía S-nitrosilación dependiente de NO, inicia los eventos que llevan al aumento de Ca2+ gatillado por la estimulación de los mGluR en los astrocitos. La consecuente liberación de ATP a través de CALHM1 induce la apertura de canales de Cx43 y Panx-1, los cuales junto con la activación de los receptores purinérgicos contribuyen al aumento de Ca2+ mediado por los mGluR durante el acoplamiento neurovascular.
Determinants of differential functions of galectin-8 on T cells and tumoral cells : interplay of galectin-8 isoforms, integrin and growth factor signaling pathways.
(2014) Döger, Remziye; González de la Rosa, Alfonso; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Galectins are a subfamily of lectins involved in a variety of cellular processes mainly related with the immune system and cancer. Galectins are secreted through unconventional mechanisms, because they lack a signal peptide, and their carbohydrate recognition domains (CRD) bind to N-acetyllactosamine residues present on cell surface N- and O-glycoconjugates. Each of the 15 galectin family members can have redundant as well as particular functions depending on the structural organization of their CRDs, which is classified in three major groups: Monomeric chimera-type design (Gal-3); Homodimeric prototype (Gal-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, and -15); Tandem-repeat type with two different CRDs connected by a linker peptide (Gal-4, -6, -8, -9 and -12). The function of each particular member can also vary in different cellular contexts through mechanisms still not well understood, but likely dependent on differential subsets of glycoproteins and signaling pathways engaged. Therefore, understanding the role of a particular galectin requires to define the determinants of its variable functions in different cellular contexts.
Development of recombinant BCG vacciones targeting Andes orthohantavirus and respiratory syncytial virus : evaluation on murine and bovine models
(2021) Díaz Acevedo, Fabián Esteban; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El virus respiratorio sincicial humano es el principal agente causante de infecciones del tracto respiratorio bajo y neumonía en infantes a nivel mundial. Por otra parte, el síndrome cardiopulmonar por hantavirus causado por Andes orthohantavirus es una zoonosis altamente letal presente en Chile. Actualmente no se cuenta con medidas preventivas eficaces para prevenir las enfermedades respiratorias causadas por estos patógenos. Al respecto, una vacuna BCG recombinante que expresa la nucleoproteína de VRSh (rBCG-N-hRSV) ha mostrado ser protectora frente a VRSh en ratones, generando inmunidad antiviral Th1, además de ser segura e inmunogénica en voluntarios adultos. Con el fin de evaluar a nivel preclínico esta vacuna en neonatos, usamos un modelo de infección con VRS bovino en terneros. La vacunación de terneros no evidenció efectos adversos sistémicos. Además, generó un aumento de la inmunidad humoral local y celular específica contra VRSb a los 7 dpi. Finalmente, los terneros vacunados con rBCG-N-hRSV generaron una enfermedad clínica reducida en comparación a terneros no vacunados. Paralelamente, generamos una nueva rBCG que expresa la nucleoproteína de ANDV, y evaluamos la seguridad e inmunogenicidad de ésta en un modelo murino. La administración de rBCG-N-ANDV fue bien tolerada por ratones, sin causar efectos sistémicos adversos. La vacunación generó respuestas linfocitarias N-ANDV específicas asociadas a aumento de secreción de IFN-γ, y aumento de IgG N-ANDV específica a los 28 días post vacunación. Nuestros resultados sugieren que estas vacunas BCG son bien toleradas e inmunogénicas, siendo candidatas promisorias para generar inmunidad Th1 contra virus respiratorios, garantizando futuras evaluaciones.
Development of recombinant vaccines to prevent the disease caused by the respiratory viruses SARS-CoV-2, hMPV, and hRSV
(2022) Gálvez Arriagada, Nicolás Marcelo Salvador; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las infecciones respiratorias se encuentran entre las enfermedades más comunes en todo el mundo y el SARS-CoV-2, hRSV y hMPV son los principales virus que aumentan estas cifras. El SARS-CoV-2 es el agente viral responsable del COVID-19 y de la actual pandemia en curso en todo el mundo. Se han generado varias vacunas para enfrentar esta pandemia, pero se ha demostrado que la aparición de variantes de interés reduce la inmunidad inducida por la vacuna contra el SARS-CoV-2. El hMPV y el hRSV son las principales causas de infecciones agudas del tracto respiratorio inferior, con tasas significativas de morbilidad y mortalidad en poblaciones pediátricas y geriátricas, pero a pesar de su impacto en todo el mundo, hasta la fecha no se han aprobado vacunas contra estos dos virus. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) es la vacuna actualmente utilizada contra la Tuberculosis. Esta vacuna suele administrarse a recién nacidos y tiene perfiles de seguridad e inmunogenicidad ampliamente descritos. BCG promueve una polarización Th1 de células T CD4+, y se ha utilizado como vector para la expresión de antígenos heterólogos, con correlatos positivos de protección contra diferentes patógenos intracelulares. Esto condujo al uso de diferentes BCG recombinantes (rBCG) como vectores para la expresión de antígenos virales, con el fin de inducir respuestas inmunes polarizadas Th1 contra los virus correspondientes. Aquí se reporta el desarrollo y la caracterización de tres prototipos de vacunas rBCG diferentes. En primer lugar, se generó una cepa de rBCG que expresa la Nucleoproteína del SARS-CoV-2 (rBCG-N-SARS-CoV-2) y se evaluó su seguridad e inmunogenicidad. Se probaron esquemas de vacunación heterólogos para potenciar la respuesta inmunitaria provocada tras la vacunación. Esta vacuna demostró ser segura, detectándose importantes respuestas inmunitarias celulares y humorales, caracterizadas por la activación de células T CD4+ y CD8+, aumento de la secreción de citoquinas relacionadas con una respuesta Th1 y aumento de la secreción de anticuerpos anti-N-SARS-CoV-2. Estos datos sugieren que este prototipo de vacuna podría ser una plataforma eficaz para prevenir la enfermedad causada por el SARS-CoV-2 y ayudar a reducir el impacto de esta pandemia a nivel mundial. Se evaluaron la eficacia y la inmunogenicidad de una rBCG que expresa la fosfoproteína de hMPV (rBCG-P-hMPV) en un proceso buenas prácticas de manufactura (cGMP). La vacuna cGMP rBCG-P-hMPV fue segura e indujo una respuesta inmune humoral y celular protectora en ratones, como lo demuestra un menor número de cargas virales e infiltración de células en los pulmones, un aumento significativo en la activación de las células T, la secreción de citocinas proinflamatorias en su mayoría relacionadas con un perfil Th1, y la secreción de anticuerpos IgG e IgA contra hMPV. Estos resultados serán una piedra angular para la proyección de esta vacuna en ensayos clínicos con humanos. Reportes anteriores muestran que la inmunización con una cGMP rBCG que expresa la nucleoproteína del hRSV (rBCG-N-hRSV) protege contra este virus en ratones. En Chile se realizó un ensayo clínico fase 1 para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de esta vacuna. Las muestras obtenidas se utilizaron para caracterizar la respuesta inmunitaria provocada tras la vacunación. Se detectó una respuesta celular significativamente mayor en diferentes momentos, junto con mayores niveles de anticuerpos circulantes contra antígenos de Mycobacterium y hRSV. Estos resultados caracterizan aún más la respuesta inmune provocada en humanos por esta vacuna contra hRSV. El desarrollo y caracterización de todas estas vacunas serán datos valiosos para la generación de tratamientos profilácticos seguros y efectivos contra estos virus respiratorios, que posiblemente podrían ser administrados a la población pediátrica.
Disfunción vascular en HFpEF: rol de la señalización simpática en la remodelación y actividad vascular adversa
(2024) Saavedra Álvarez, Andrea Stephanie; Río, Rodrigo del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La falla cardíaca es un síndrome causado por anormalidades cardíacas estructurales y funcionales, dentro de sus fenotipos clínicos se encuentra la falla cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF), que se define por tener una fracción de eyección ventricular izquierda ³ 50% y representa el 50% de los pacientes con falla cardíaca. El riesgo de padecer HFpEF aumenta con la edad y se incrementa con factores de riesgo adicionales que incluyen la hipertensión, obesidad, diabetes y enfermedades arterial coronaria. Dentro de las anormalidades presentadas en HFpEF está la disfunción y remodelamiento ventricular izquierdo, anormal acoplamiento ventrículo-arterial, incompetencia cronotrópica y rigidez miocárdica. Entre los mecanismos claves asociados a la generación de estas irregularidades está la inflamación microvascular asociada al desarrollo de disfunción endotelial microvascular coronaria, otro mecanismo es la disfunción endotelial sistémica que afecta la microvasculatura, ambas asociadas a una disminución en la biodisponibilidad de óxido nitrico, impactando en la vasodilatación dependiente de endotelio en pequeñas arterias, lo cual es acompañado de incremento del colágeno miocárdico, reducción del radio capilar y elevado incremento del contenido de colágeno en el miocardio, que consecuentemente incrementa la rigidez ventricular izquierda de fin de diástole. La relevancia de la disfunción vascular es tal, que la disminución de la biodisponibilidad de óxido nitrico y estrés oxidativo en HFpEF ha demostrado ser fundamental en el estrés metabólico e hipertensivo. Por otra parte, la desregulación autonómica, presente en todas las patologías cardiovasculares, cumpliría un papel importante en HFpEF, ya que está presente en pacientes y se asociaba con mayor mortalidad. Sin embargo, no se conoce como el desbalance del sistema autónomo ncide en las alteraciones vasculares que ocurren en HFpEF. En base a estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis “La disfunción vascular en HFpEF se asocia a remodelación anatómica de las arterias y cambios en la señalización adrenérgica en las arterias de ratones”. Esto se estudiará determinando: 1. El remodelamiento vascular aórtico en ratones HFpEF. 2. El estado de reactividad y función aórtica en ratones HFpEF. 3. La respuesta aórtica asociada a inducción simpática en ratones HFpEF y 4. La disminución de la inervación simpática en aorta de ratones HFpEF. La estrategia experimental involucro el uso de un modelo de ratón al cual se le indujo el estado de HFpEF, a partir de él se obtuvo la aorta abdominal la cual se procesó para evaluación histológica mediante tinción hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, la reactividad vascular se estudió con el uso de un miógrafo en el cual la aorta se montó y se sometió a diversos agentes vasoactivos como potasio, fenilefrina, acetilcolina, NG-nitro-L-arginina metil éster, prazosina (inhibidor de receptor a-adrenérgico) y propanolol (inhibidor de receptor b-adrenérgico). La inervación simpática se evaluó con la expresión relativa de tirosina hidroxilasa. Además, se estudió la expresión del a1 adrenoreceptor, a2 adrenoreceptor, b2 adrenoreceptor y b3 adrenoreceptor. Los resultados muestran cambios morfológicos en la aorta de ratón HFpEF, asociado a una disminución del diámetro arterial con aumento del grosor de las capas que conforman las paredes del vaso, la capa íntima y la media. La evaluación de fibrosis en el tejido aórtico indico un aumento de este parámetro en asociación con una disminución del contenido muscular de la capa media vascular, que se condice con una baja expresión de la actina del músculo liso. En la evaluación de la reactividad vascular la aorta de ratón HFpEF no exhibió cambios respecto al control frente a agentes vasoconstrictores como la fenilefrina, pero si frente a acetilcolina donde no presentó capacidad vaso relajante, la inhibición de a y b adrenoreceptores presentaron disminución importante en la vasoconstricción aórtica. En la evaluación de la regulación autonómica se observa una disminución de la expresión de tirosina hidroxilasa y de los adrenoreceptores evaluados. En conclusión, estos resultados sugieren que aorta de ratón HFpEF que representa la macrovasculatura arterial, presenta alteraciones morfológicas y funcionales que pueden contribuir al desarrollo u mantención de la disfunción vascular en HFpEF.
Disfunción vascular inducida por la liberación de CGRP desde los nervios sensoriales perivasculares.
(2015) Gaete Pauchard, Pablo Simón; Figueroa, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La regulación de la presión arterial y de la distribución del flujo sanguíneo depende del control del grado de contracción del músculo liso (i.e. tono vasomotor) que recubre las arterias de resistencia. Además del músculo liso, la pared de estos vasos está compuesta por una capa de células endoteliales, las cuales controlan el tono vasomotor mediante la liberación de agentes vasodilatadores, principalmente, el óxido nítrico (NO) y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF). Las células de la pared vascular están conectadas entre sí por canales intercelulares formados por conexinas, los cuales transmiten el NO y el EDHF a las células musculares lisas adyacentes y permiten la coordinación de la función vascular. Las conexinas también forman hemicanales, los cuales conectan el compartimiento intracelular con el espacio extracelular. La panexina-1 (Panx-1) forma canales estructuralmente similares a los hemicanales formados por las conexinas. Interesantemente, la activación de ambos, los hemicanales formados por conexinas o los canales de Panx-1, ha sido ampliamente asociada a procesos inflamatorios y a disfunción celular. Las arterias de resistencia están inervadas por fibras sensoriales sensibles a capsaicina que liberan el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) durante condiciones inflamatorias. Notablemente la inflamación conduce a la reducción de la vasodilatación dependiente del NO y del EDHF; no obstante, los mecanismos que median este fenómeno se desconocen. Basado en estos antecedentes, la hipótesis de este trabajo es que el CGRP induce la activación de los canales de Panx-1 en el endotelio vascular, lo cual conduce a la pérdida de la señalización del NO y a la inhibición del acoplamiento intercelular mediado por uniones comunicantes.
Efecto de la insulinoterapia en el endotelio fetoplacentario de embarazos con diabetes mellitus gestacional.
(2020) Subiabre Morales, Mario Enrique; Sobrevía Luarte, Luis Alberto; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Diabetes mellitus gestacional (DMG) se asocia con mayor transporte de L-arginina y formación de óxido nítrico (NO), así como un aumento en la expresión del transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 humano (hCAT-1) y de la NO sintasa endotelial (eNOS) (i.e. ruta L-arginina/NO) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Insulina exógena activa receptores de insulina (IR) lo cual resulta en menor transporte de L-arginina vía hCAT-1 y la síntesis de NO vía eNOS en HUVECs de DMG. Este efecto de insulina exógena podría deberse a expresión y activación diferencial de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) de IR. Conociendo que los efectos biológicos de insulina son regulados por receptores de adenosina, se estudió si la insulinaterapia en DMG (DMGi) afecta el aumento de la expresión y actividad de la ruta L-arginina/ NO y si estos fenómenos son bloqueados por insulina exógena mediante la activación diferencial de IR-A y/o IR-B y receptores de adenosina. La actividad de la ruta L-arginina/NO está aumentada en DMGi, un efecto que es revertido por insulina exógena corrigiendo la expresión y señalización de IR-A. La disfunción de la ruta L-arginina/NO también involucra la actividad de los receptores de adenosina A2A (A2AAR). El efecto de insulina en DMGi requirió de la actividad de receptores de adenosina A1 (A1AR) y A2AAR para normalizar el transporte de L-arginina. El efecto de insulina fue bloqueado por un inhibidor de la señalización de la insulina vía IR-A. Este estudio sugiere que la terapia con insulina en mujeres con DMG (DMGi) no revierte el aumento de la ruta Larginina/NO en HUVECs. Insulina exógena revierte el efecto de DMGi sobre la actividad y expresión de la ruta L-arginina/NO mediante un mecanismo que requiere actividad de A1AR e IR-ADiabetes mellitus gestacional (DMG) se asocia con mayor transporte de L-arginina y formación de óxido nítrico (NO), así como un aumento en la expresión del transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 humano (hCAT-1) y de la NO sintasa endotelial (eNOS) (i.e. ruta L-arginina/NO) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Insulina exógena activa receptores de insulina (IR) lo cual resulta en menor transporte de L-arginina vía hCAT-1 y la síntesis de NO vía eNOS en HUVECs de DMG. Este efecto de insulina exógena podría deberse a expresión y activación diferencial de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) de IR. Conociendo que los efectos biológicos de insulina son regulados por receptores de adenosina, se estudió si la insulinaterapia en DMG (DMGi) afecta el aumento de la expresión y actividad de la ruta L-arginina/ NO y si estos fenómenos son bloqueados por insulina exógena mediante la activación diferencial de IR-A y/o IR-B y receptores de adenosina. La actividad de la ruta L-arginina/NO está aumentada en DMGi, un efecto que es revertido por insulina exógena corrigiendo la expresión y señalización de IR-A. La disfunción de la ruta L-arginina/NO también involucra la actividad de los receptores de adenosina A2A (A2AAR). El efecto de insulina en DMGi requirió de la actividad de receptores de adenosina A1 (A1AR) y A2AAR para normalizar el transporte de L-arginina. El efecto de insulina fue bloqueado por un inhibidor de la señalización de la insulina vía IR-A. Este estudio sugiere que la terapia con insulina en mujeres con DMG (DMGi) no revierte el aumento de la ruta Larginina/NO en HUVECs. Insulina exógena revierte el efecto de DMGi sobre la actividad y expresión de la ruta L-arginina/NO mediante un mecanismo que requiere actividad de A1AR e IR-ADiabetes mellitus gestacional (DMG) se asocia con mayor transporte de L-arginina y formación de óxido nítrico (NO), así como un aumento en la expresión del transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 humano (hCAT-1) y de la NO sintasa endotelial (eNOS) (i.e. ruta L-arginina/NO) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Insulina exógena activa receptores de insulina (IR) lo cual resulta en menor transporte de L-arginina vía hCAT-1 y la síntesis de NO vía eNOS en HUVECs de DMG. Este efecto de insulina exógena podría deberse a expresión y activación diferencial de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) de IR. Conociendo que los efectos biológicos de insulina son regulados por receptores de adenosina, se estudió si la insulinaterapia en DMG (DMGi) afecta el aumento de la expresión y actividad de la ruta L-arginina/ NO y si estos fenómenos son bloqueados por insulina exógena mediante la activación diferencial de IR-A y/o IR-B y receptores de adenosina. La actividad de la ruta L-arginina/NO está aumentada en DMGi, un efecto que es revertido por insulina exógena corrigiendo la expresión y señalización de IR-A. La disfunción de la ruta L-arginina/NO también involucra la actividad de los receptores de adenosina A2A (A2AAR). El efecto de insulina en DMGi requirió de la actividad de receptores de adenosina A1 (A1AR) y A2AAR para normalizar el transporte de L-arginina. El efecto de insulina fue bloqueado por un inhibidor de la señalización de la insulina vía IR-A. Este estudio sugiere que la terapia con insulina en mujeres con DMG (DMGi) no revierte el aumento de la ruta Larginina/NO en HUVECs. Insulina exógena revierte el efecto de DMGi sobre la actividad y expresión de la ruta L-arginina/NO mediante un mecanismo que requiere actividad de A1AR e IR-ADiabetes mellitus gestacional (DMG) se asocia con mayor transporte de L-arginina y formación de óxido nítrico (NO), así como un aumento en la expresión del transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 humano (hCAT-1) y de la NO sintasa endotelial (eNOS) (i.e. ruta L-arginina/NO) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Insulina exógena activa receptores de insulina (IR) lo cual resulta en menor transporte de L-arginina vía hCAT-1 y la síntesis de NO vía eNOS en HUVECs de DMG. Este efecto de insulina exógena podría deberse a expresión y activación diferencial de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) de IR. Conociendo que los efectos biológicos de insulina son regulados por receptores de adenosina, se estudió si la insulinaterapia en DMG (DMGi) afecta el aumento de la expresión y actividad de la ruta L-arginina/ NO y si estos fenómenos son bloqueados por insulina exógena mediante la activación diferencial de IR-A y/o IR-B y receptores de adenosina. La actividad de la ruta L-arginina/NO está aumentada en DMGi, un efecto que es revertido por insulina exógena corrigiendo la expresión y señalización de IR-A. La disfunción de la ruta L-arginina/NO también involucra la actividad de los receptores de adenosina A2A (A2AAR). El efecto de insulina en DMGi requirió de la actividad de receptores de adenosina A1 (A1AR) y A2AAR para normalizar el transporte de L-arginina. El efecto de insulina fue bloqueado por un inhibidor de la señalización de la insulina vía IR-A. Este estudio sugiere que la terapia con insulina en mujeres con DMG (DMGi) no revierte el aumento de la ruta Larginina/NO en HUVECs. Insulina exógena revierte el efecto de DMGi sobre la actividad y expresión de la ruta L-arginina/NO mediante un mecanismo que requiere actividad de A1AR e IR-A
Efectos de la vía de señalización WNT sobre la permeabilidad mitocondrial inducida por oligómeros del péptido \03B2-amiloide.
(2014) Arrazola Tello, Macarena Soledad; Inestrosa Cantín, Nibaldo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Effect of hypoxia in skeletal muscle fibrosis : regulation of CTGF/CCN2 expression by HIF-1α and TGF-β.
(2019) Valle Tenney, Roger Christian; Brandan, Enrique; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.
Elucidation of the compounds involved in the appearance of an herbaceous off-flavor which affects quality of sweet cherry (Prunus avium l.) Cv. Regina
(2024) Villavicencio Romero, Juan David; Zoffoli, Juan Pablo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Este trabajo busca identificar los compuestos responsables del sabor herbáceo en la cereza (Prunus avium L.) cv. Regina, percibido por productores y consumidores. Se enfocó en el análisis de metabolitos volátiles y la expresión génica durante el desarrollo del fruto. El estudio se realizó en seis huertos del centro-sur de Chile, comparando la calidad y composición de volátiles. Mediante microextracción en fase sólida y cromatografía de gases-masas, se identificaron 39 volátiles. Las cerezas con sabor herbáceo mostraron mayor concentración relativa de aldehídos de seis carbonos y menor de alcoholes y ésteres, lo que sugiere un retraso en la maduración. Además, se caracterizó la familia de genes LOX en cereza y se cuantificó su expresión mediante RT-qPCR durante el desarrollo del fruto. Se evaluó el efecto del metil jasmonato en la reducción del sabor herbáceo, la distribución de volátiles y la expresión de los genes LOX, identificando a PaLOX10, PaLOX11 y PaLOX12 como candidatos clave en la producción de volátiles asociados a este sabor. Estos resultados ofrecen información útil para mejorar las prácticas de manejo para reducir la incidencia de sabor herbáceo, así como para los programas de mejoramiento genético en Chile.

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Browsing 3.06 Tesis doctorado by browse.metadata.categoria "Medicina y salud"

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