Análisis de los cambios tempranos del transcriptoma en respuesta al daño en la médula espinal de Xenopus laevis.
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Date
2019
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Abstract
A diferencia de los mamíferos, otros animales como las larvas de anfibios anuros (donde se
incluye a Xenopus) pueden lograr una recuperación funcional completa después de una lesión
en la médula espinal. En nuestro laboratorio, se ha establecido a la rana Xenopus laevis (X.
laevis) como un organismo modelo para estudiar la regeneración de la médula espinal. Una de
las principales ventajas de X. laevis es que las larvas en etapas 50-54 (estadios-R) pueden
recuperarse anatómica, histológica y funcionalmente después de una lesión en la médula espinal
(LME). Esas habilidades se pierden por completo en las ranas juveniles (estadio-NR). La zona
ependimaria del canal central de la médula espinal de las larvas en estadios-R presenta un alto
porcentaje de células progenitoras neuronales (NPC) Sox2+. Estas se activan rápidamente en
respuesta a una lesión y son necesarias para lograr la regeneración completa de la médula
espinal. Nuestro interés es identificar las redes genéticas y las vías de señalización
involucradas en la activación temprana de NPC.
Para identificar los mecanismos y las vías de señalización involucradas en la activación de
células Sox2+, hemos realizado un análisis de los cambios del transcriptoma durante las
primeras 21 horas posteriores a la transección (hpt) en animales en estadios-R. Con este
objetivo, el tejido del sitio de la lesión se aisló cada 1 hora luego de la lesión en animales
transectados, así como también en animales control, con daño simulado (sham) y sin daño.
Como resultado de este muestreo y posterior secuenciación de ARNm conseguimos más de 100
librerías de RNA-seq, con las cuales se realizó un exhaustivo análisis bioinformático. Los genes
expresados diferencialmente (GEDs) se identificaron mediante Procesos Gaussianos.
Posteriormente, la estructura modular de los GEDs se infirió utilizando un Análisis de redes de
Co-expresión Génica Ponderada (WGCNA). Estos módulos de co-expresión fueron analizados buscando procesos biológicos y vías de señalización KEGG enriquecidas. Además, analizamos
los motivos de unión al ADN de factor de transcripción enriquecidos en el promotor proximal
de genes coexpresados y las interacciones proteína-proteína entre los GEDs.
Identificamos 1850 GEDs que se agruparon en 11 módulos de coexpresión (3 regulados
negativamente, 2 regulados positivamente con una activación inmediata, 3 regulados
positivamente con una activación intermedia y 3 regulados positivamente con una activación
tardía). El análisis de ontología génica reportó: (1) un enriquecimiento de los reguladores
negativos de la señalización mTOR en los primeros módulos regulados negativamente, (2) un
aumento en factores de transcripción en los módulos de activación inmediata, (3) un aumento
en los componentes de la biogénesis del ribosoma en módulos de activación intermedia y (4) un
aumento en genes asociados a división de células progenitoras y de ciclo celular en módulos de
activación tardía.
En base a nuestros análisis bioinformáticos decidimos estudiar el rol de la vía mTOR
durante las primeras horas luego de la transección. Análisis por Western Blot e
Inmunofluorescencia contra p-S6, la forma activa de un componente intracelular de la vía
mTOR, mostraron una activación rápida a las 3 hpt y principalmente en las células de la zona
ependimaria del canal central cercanas al sitio de la lesión y los cuerpos neuronales a lo largo
del sistema nervioso. La inhibición de esta vía de señalización utilizando rapamicina bloquea la
proliferación de células Sox2+ y la recuperación funcional después de la LME. Estos resultados
sugieren un papel clave para la vía mTOR en la rápida activación de las células Sox2+ para una
adecuada recuperación después de la LME en renacuajos.
De esta manera, podemos concluir que identificamos cambios tempranos en el
transcriptoma de la médula espinal en respuesta al daño a la médula espinal, los cuales pueden ser asociados a varios procesos biológicos y vías de señalización que se despliegan en ondas
transcripcionales secuenciales después de la LME. Finalmente, análisis bioinformáticos y
pruebas funcionales de la vía mTOR sugieren que esta vía de señalización sería clave durante
las primeras horas de la regeneración de la médula espinal.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias con mención en Biología Celular y Molecular)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019