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- ItemRole of the Mitophagy Protein PINK1 in Hypothalamic Neurons: Regulation of Energy Balance and Glucose Homeostasis(2024) Díaz Castro, Francisco Leopoldo; Pérez Leighton, Claudio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasThe mediobasal hypothalamus (MBH), particularly the arcuate nucleus (ARC), is a brain region essential for regulating energy balance, glucose metabolism, and feeding behavior. Hypothalamic neurons adapt to different metabolic challenges, such as fasting or high-fat diet (HFD) consumption, to maintain energy homeostasis. Mitochondria contribute to this process by undergoing reshaping, rebuilding, and recycling— processes that together are known as mitochondrial dynamics. Mitophagy, the process of recycling mitochondria through autophagy, ensures the selective removal of damaged mitochondria, maintaining mitochondrial and cellular function under basal metabolic conditions or during metabolic stress. Despite its importance in mitochondrial and cellular function, the function of mitophagy in hypothalamic neurons and their role in regulating energy balance remains poorly understood. This thesis aimed to elucidate the role of mitophagy in hypothalamic neurons, focusing on its impact during fasting and HFD-induced obesity. We observed that both fasting and HFD altered mitophagy-related genes and protein levels in the MBH. Notably, the mRNA levels of the mitophagy protein PINK1, the main regulator of mitophagy, were lower in HFD mice compared to control mice, correlating with impaired fasting-induced food intake. To further explore this, we downregulated PINK1 in AgRP and POMC neurons. PINK1 knockdown in AgRP neurons, but not in POMC neurons, increased body weight, impaired glucose metabolism, and altered adiposity despite no changes in basal or fasting-induced food intake. Experiments in a hypothalamic neuronal cell line revealed that PINK1 is essential for starvation-induced mitophagy. Collectively, these findings show that PINK1 is necessary for maintaining hypothalamic neuronal function and metabolic homeostasis.
- ItemUPRmt activation induced by canonical Wnt signaling: a new protective mechanism against Alzheimer’s Disease(2024) Torres Juacida, Angie Kim; Inestrosa Cantín, Nibaldo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa Enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común a nivel mundial, caracterizada por una pérdida de memoria progresiva y la formación de agregados proteicos formados por el péptido beta amiloide (Aβ), y por la proteína tau fosforilada. Estos agregados promueven disfunción sináptica, causada por alteración mitocondrial y por la desregulación de diversas vías de señalización. Dentro de las vías de señalización que se ven afectadas y están disminuidas en la EA está la vía Wnt canónica; de hecho, esta vía de señalización ha sido altamente asociada a su patogénesis. La activación de esta vía de señalización genera la traslocación de β-catenina al núcleo donde induce la transcripción de sus genes blancos al unirse a los factores de transcripción TCF/LEF y a los coactivadores CBP y p300. Además, activar la vía Wnt canónica en modelos de la EA mejora la memoria, disminuye los niveles de Aβ y de tau fosforilada, y mejora la funcionalidad mitocondrial, esto último por un mecanismo que no ha sido bien descrito. En condiciones de estrés, tales como la EA, la respuesta a estrés mitocondrial a proteínas mal plegadas (UPRmt por sus siglas en inglés) se ha visto activada. El UPRmt es una señalización retrógrada mitocondria-núcleo, la cual se activa frente a la acumulación de proteínas mal plegadas en la mitocondria, lo que se ha descrito que activa a la proteasa Oma1, quien lleva la señal hacia el citoplasma e induce la transcripción de chaperonas como Hsp60 y mtHsp70 y proteasas mitocondriales como Clpp y Lonp1 para plegar y/o degradar estas proteínas. Por lo tanto, su activación en la EA es posiblemente una respuesta frente a la acumulación del péptido Aβ y de la proteína tau fosforilada en las mitocondrias, lo que se ha descrito que ocurre en la EA; sin embargo, esta activación pareciera no ser suficiente para atenuar el daño mitocondrial y el progreso de la EA. En contraste, la activación farmacológica del UPRmt en pacientes y modelos animales de la EA disminuye los niveles de Aβ, sugiriendo que la estimulación de las vías de señalización que controlan esta respuesta a estrés podría disminuir los niveles de Aβ y tau fosforilada en la EA al mejorar la función de las mitocondrias. Interesantemente, CBP y p300 son importantes reguladores de la transcripción de genes asociados a UPRmt. Así, la activación tanto de la vía Wnt canónica como de la respuesta UPRmt han sido descritas como una posible forma de reducir la patología de la EA. Sin embargo, la relación entre estas dos vías de señalización ha sido poco descrita. Considerando que CBP y p300 son importantes reguladores del UPRmt y que además son coactivadores transcripcionales de β-catenina en la señalización Wnt canónica, se propone la siguiente hipótesis: “La activación de la vía Wnt canónica induce la expresión de las proteínas asociadas al UPRmt, disminuyendo la patología de Aβ y tau en la EA”. Para evaluar esto se realizaron tratamientos farmacológicos in vitro para modular la vía Wnt canónica y se observó que al aumentar la vía Wnt, tanto con ANDRO como con el ligando recombinante Wnt7a, aumentan los niveles de proteínas asociadas al UPRmt tales como el factor de transcripción ATF5, la chaperona Hsp60 y las proteasas Oma1, Lonp1 y ClpP. Por el contrario, al inhibir la vía Wnt mediante ICG001, los niveles de estas proteínas asociadas al UPRmt disminuyen; efectos que se observan también en los niveles de mRNA. Además, se realizó un enfoque in vivo con el nemátodo Caenorhabditis elegans (C. elegans), donde se utilizó una cepa transgénica reportera para UPRmt, donde la expresión de GFP está ligada a la actividad del promotor de la chaperona Hsp6 (homologo a mtHsp70). En estos nematodos se moduló la vía Wnt mediante la sobreexpresión del ligando Wnt Egl-20 y la expresión de una forma mutante no funcional de este mismo ligando. Mediante microscopía de fluorescencia se observó que los C. elegans que poseían el ligando Wnt mutado tenían menor nivel de fluorescencia al inducir UPRmt, mientras que sobreexpresar el ligando Wnt aumenta los niveles de fluorescencia. Asimismo, la activación de la vía Wnt mediante ANDRO en el ratón SAMP8 genera la acumulación de ATF5 en el núcleo y aumenta los niveles de Lonp1 mitocondrial, lo que coincide con los resultados observados in vitro. Estos resultados sugieren que la activación de la vía Wnt canónica induciría un aumento en la expresión de proteínas mitocondriales asociadas al UPRmt, siendo una de las vías de señalización que regula la expresión de estas proteínas. Además, mediante bioinformática se observó la presencia de elementos TCF/LEF en los promotores (2,000 pb rio arriba del sitio de inicio de la transcripción) de los genes del UPRmt, sugiriendo que estos podrían ser genes blanco de la vía Wnt canónica. Finalmente, se evaluó la contribución de esta regulación mediada por la vía Wnt en los efectos positivos que tiene su activación en la EA. A pesar de que no se observaron efectos positivos asociados a la activación de la vía Wnt canónica contra los efectos del péptido Aβ en una cepa de C. elegans modelo de la EA, se observó que la disminución del UPRmt dada por una deleción en el gen atfs-1 potencia la deficiencia sensorial provocada por Aβ. Sin embargo, en el ratón triple transgénico modelo de la EA, la activación de la vía Wnt disminuyó los niveles de Aβ y tau fosforilada, lo que fue inhibido al estar reducido el UPRmt, dado por una disminución en los niveles de ATF5, sugiriendo que la inducción de la expresión de las proteínas asociadas al UPRmt podría ser un nuevo mecanismo por el cual la vía Wnt canónica mejora la patología de la EA.
- ItemVariaciones en la composición de especies de macroinvertebrados de playas de arena a lo largo de un gradiente latitudinal en Chile y efectos a escala local de variables marinas y terrestres(2024) Hernández Contreras, Juan Carlos; Fariña Rivas, José Miguel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
- ItemAstrocytes from the retrotrapezoid nucleus drives chemoreceptor neuron hyper-responsiveness to hypercapnia in heart failure: role of oxidative stress and glutamate spill-over(2024) Díaz Jara, Esteban; Río Troncoso, Rodrigo Andre del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa insuficiencia cardiaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una enfermedad crónica caracterizada por una alta prevalencia de desórdenes respiratorios e irregularidades en el patrón ventilatorio, las cuales están estrechamente asociados con la potenciación del quimiorreflejo central. El principal núcleo quimiorreceptor central es el núcleo retrotrapezoide (RTN), ubicado en la superficie del tronco encefálico, que contiene neuronas que frente a un estímulo hipercápnico propagan potenciales de acción excitatorios hacia los centros respiratorios, modulando el patrón respiratorio. En modelos preclínicos de ICFEP, la eliminación selectiva de las neuronas quimiorreceptoras del RTN normaliza la quimiorrefleja central y elimina la irregularidad en el patrón respiratorio. Sin embargo, los mecanismos celulares que potencian la función del RTN durante la ICFEP no se han estudiado previamente. En los últimos años, se ha demostrado que, además de las neuronas quimiorreceptoras, los astrocitos ubicados en el RTN desempeñan un papel clave en la regulación de la quimiorrecepción en condiciones normales. Sin embargo, se desconoce el rol de estas células en el control de la quimiorecepción central durante la ICFEP. Por lo tanto, propuse como hipótesis que "El estrés oxidativo aumenta el impulso del quimioreflejo central en la ICFEP al reducir la captación de glutamato mediada por los astrocitos en el núcleo retrotrapezoide". Los objetivos principales de esta tesis doctoral fueron: i) Determinar los niveles de estrés oxidativo y glutamato en el RTN y estudiar la contribución del estrés oxidativo en las respuestas exageradas del quimiorreflejo central en ratas con ICFEP; ii) Determinar las alteraciones en la morfología de los astrocitos y la localización y expresión del transportador de glutamato-1 (GLT-1) en el RTN de ratas con ICFEP; iii) Determinar la actividad neuronal en secciones del tronco encefálico que contienen el RTN de ratas con ICFEP; y iv) Determinar si la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de ratas con ICFEP restaura la respuesta normal de las neuronas quimiorreceptoras a la hipercapnia. La ICFEP fue inducida en ratas Sprague Dawley machos adultos (~250 g) mediante una fístula arteriovenosa. Se utilizó pletismografía de cuerpo entero para evaluar tanto la respuesta ventilatoria a la hipercapnia (FiCO2 7%), como el patrón respiratorio en reposo. Los niveles del anión superóxido y de superóxido dismutasa 2 en el RTN se determinaron por tinción con dihidroetidio (DHE) y Western Blot, respectivamente. La morfología de los astrocitos y los niveles de GLT-1 en el RTN se determinaron mediante inmunofluorescencia y RNAscope, respectivamente. La localización celular de SOD2 y de GLT-1 se realizó mediante análisis bioinformáticos. Los niveles de glutamato extracelular en el RTN se midieron en animales anestesiados, y posteriormente mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para evaluar la actividad de las neuronas quimiorreceptoras RTN, se realizaron inyecciones estereotáxicas de un adenovirus que permitió la expresión de un sensor de calcio citoplasmático (GCaMP6s) en las neuronas. Posteriormente se analizaron los cambios de fluorescencia en las secciones del tronco encefálico que contenían el RTN mediante microscopía confocal. Finalmente, la sobreexpresión de GLT-1 en astrocitos RTN fue realizada por la inyección estereotáxica de un adenovirus que permitió la expresión del transportador de glutamato-1 bajo el promotor específico de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los animales con ICFEP presentaron un aumento en los niveles del anión superóxido en el RTN, los cuales están estrechamente relacionados con la potenciación del quimiorreflejo central en animales ICFEP. El aumento de los niveles de superóxido en el RTN se asoció con la disminución en los niveles de expresión de SOD2, tanto a nivel de mRNA y proteína, en los animales con ICFEP. En paralelo, animales con una disminución parcial de SOD2 presentan un aumento en los niveles de superóxido en el RTN los cuales se correlacionan con la potenciación del quimiorreflejo central, similar a lo observado en animales con ICFEP. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que SOD2 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN en lugar de en las neuronas quimiorreceptoras. Las ratas con ICFEP presentan un aumento en los niveles de glutamato extracelular en el RTN tanto en condiciones basales como durante el estímulo hipercápnico comparado con animales Sham. Tanto las ratas con ICFEP como en animales con una disminución parcial de SOD2 presentan una disminución en la morfología de los astrocitos del RTN. Interesantemente se observó que los animales con ICFEP presentan una disminución en la tinción de NMB, el marcador de neuronas quimiorreceptoras del RTN. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que GLT-1 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN y no en las neuronas quimiorreceptoras, y que en los animales con ICFEP, existe una disminución en los niveles de GLT-1 en el RTN. Las neuronas quimiorreceptoras del RTN de animales con ICFEP presentan un aumento de actividad tanto en condiciones basales como al ser expuestas a un medio ácido. Finalmente, la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de animales con ICFEP normaliza la actividad de las neuronas quimiorreceptoras del RTN. Además, la sobreexpresión de GLT-1 normaliza los niveles extracelulares de glutamato en el RTN, el quimiorreflejo central y el patrón respiratorio en animales con ICFEP. Estos resultados sugieren que el aumento del estrés oxidativo y la disfunción de los astrocitos en el RTN juegan un rol clave en la potenciación del quimiorreflejo y en la progresión de la ICFEP, principalmente a través la recaptación del glutamato extracelular.
- ItemDisfunción vascular en HFpEF: rol de la señalización simpática en la remodelación y actividad vascular adversa(2024) Saavedra Álvarez, Andrea Stephanie; Río, Rodrigo del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa falla cardíaca es un síndrome causado por anormalidades cardíacas estructurales y funcionales, dentro de sus fenotipos clínicos se encuentra la falla cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF), que se define por tener una fracción de eyección ventricular izquierda ³ 50% y representa el 50% de los pacientes con falla cardíaca. El riesgo de padecer HFpEF aumenta con la edad y se incrementa con factores de riesgo adicionales que incluyen la hipertensión, obesidad, diabetes y enfermedades arterial coronaria. Dentro de las anormalidades presentadas en HFpEF está la disfunción y remodelamiento ventricular izquierdo, anormal acoplamiento ventrículo-arterial, incompetencia cronotrópica y rigidez miocárdica. Entre los mecanismos claves asociados a la generación de estas irregularidades está la inflamación microvascular asociada al desarrollo de disfunción endotelial microvascular coronaria, otro mecanismo es la disfunción endotelial sistémica que afecta la microvasculatura, ambas asociadas a una disminución en la biodisponibilidad de óxido nitrico, impactando en la vasodilatación dependiente de endotelio en pequeñas arterias, lo cual es acompañado de incremento del colágeno miocárdico, reducción del radio capilar y elevado incremento del contenido de colágeno en el miocardio, que consecuentemente incrementa la rigidez ventricular izquierda de fin de diástole. La relevancia de la disfunción vascular es tal, que la disminución de la biodisponibilidad de óxido nitrico y estrés oxidativo en HFpEF ha demostrado ser fundamental en el estrés metabólico e hipertensivo. Por otra parte, la desregulación autonómica, presente en todas las patologías cardiovasculares, cumpliría un papel importante en HFpEF, ya que está presente en pacientes y se asociaba con mayor mortalidad. Sin embargo, no se conoce como el desbalance del sistema autónomo ncide en las alteraciones vasculares que ocurren en HFpEF. En base a estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis “La disfunción vascular en HFpEF se asocia a remodelación anatómica de las arterias y cambios en la señalización adrenérgica en las arterias de ratones”. Esto se estudiará determinando: 1. El remodelamiento vascular aórtico en ratones HFpEF. 2. El estado de reactividad y función aórtica en ratones HFpEF. 3. La respuesta aórtica asociada a inducción simpática en ratones HFpEF y 4. La disminución de la inervación simpática en aorta de ratones HFpEF. La estrategia experimental involucro el uso de un modelo de ratón al cual se le indujo el estado de HFpEF, a partir de él se obtuvo la aorta abdominal la cual se procesó para evaluación histológica mediante tinción hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, la reactividad vascular se estudió con el uso de un miógrafo en el cual la aorta se montó y se sometió a diversos agentes vasoactivos como potasio, fenilefrina, acetilcolina, NG-nitro-L-arginina metil éster, prazosina (inhibidor de receptor a-adrenérgico) y propanolol (inhibidor de receptor b-adrenérgico). La inervación simpática se evaluó con la expresión relativa de tirosina hidroxilasa. Además, se estudió la expresión del a1 adrenoreceptor, a2 adrenoreceptor, b2 adrenoreceptor y b3 adrenoreceptor. Los resultados muestran cambios morfológicos en la aorta de ratón HFpEF, asociado a una disminución del diámetro arterial con aumento del grosor de las capas que conforman las paredes del vaso, la capa íntima y la media. La evaluación de fibrosis en el tejido aórtico indico un aumento de este parámetro en asociación con una disminución del contenido muscular de la capa media vascular, que se condice con una baja expresión de la actina del músculo liso. En la evaluación de la reactividad vascular la aorta de ratón HFpEF no exhibió cambios respecto al control frente a agentes vasoconstrictores como la fenilefrina, pero si frente a acetilcolina donde no presentó capacidad vaso relajante, la inhibición de a y b adrenoreceptores presentaron disminución importante en la vasoconstricción aórtica. En la evaluación de la regulación autonómica se observa una disminución de la expresión de tirosina hidroxilasa y de los adrenoreceptores evaluados. En conclusión, estos resultados sugieren que aorta de ratón HFpEF que representa la macrovasculatura arterial, presenta alteraciones morfológicas y funcionales que pueden contribuir al desarrollo u mantención de la disfunción vascular en HFpEF.