C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
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2014
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Abstract
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
Considerando estos antecedentes, la hipótesis de esta tesis es: \201CLa tirosina quinasa c-Abl incrementa los niveles de HDAC2 y regula la expresión de genes neuronales\201D Para probar nuestra hipótesis, modificamos la actividad de c-Abl utilizando distintos aproximaciones in vitro e in vivo y en ellos evaluamos los niveles y actividad de HDAC2. Primero evaluamos los niveles de HDAC2 en neuronas hipocampales expuestas a oligómeros de A\03B2, un modelo que presenta un incremento en la actividad de c-Abl. Interesantemente, el tratamiento con oligómeros de A\03B2 incrementa los niveles de HDAC2; y de forma concordante con nuestra hipótesis, el pre-tratamiento con Imatinib, un inhibidor de c-Abl, previene el incremento en los niveles de HDAC2. Además, para confirmar el rol de c-Abl en la regulación de los niveles de HDAC2, transfectamos células con el plásmido que expresa c-Abl o un shRNA en contra de c-Abl; mientras la sobrexpresión de c-Abl causa un incremento significativo en los niveles de HDAC2, la reducción de los niveles de c-Abl muestra una disminución significativa de los niveles de HDAC2. Posteriormente, evaluamos el rol de c-Abl en la regulación de la actividad como represor transcripcional de HDAC2. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con Imatinib y la transfección con el plásmido de expresión para Abl-KD (forma dominante negativa de c- Abl) reducen la actividad como represor transcripcional de HDAC2. Asimismo, la sobreexpresión de c-Abl incrementa la actividad como represor transcripcional de HDAC2. En conjunto nuestros resultados confirman el rol de c-Abl sobre la actividad como represor transcripcional de HDAC2.
Luego estudiamos mediante Inmunoprecipitación de Cromatina si c-Abl regula el reclutamiento de HDAC2 en los promotores de algunos genes sinápticos seleccionados. Los resultados demuestran que el tratamiento con Imatinib reduce el reclutamiento de HDAC2 en el promotor de los genes evaluados; además demuestra que esta reducción va acompañada por un incremento en el nivel de acetilación de la histona H3 en estos mismos promotores. Concordante con estos resultados, observamos que el tratamiento con Imatinib incrementa la expresión de los genes estudiados. En conjunto, nuestros resultados demuestran que c-Abl por medio de HDAC2 regula la expresión de genes neuronales. El próximo paso fue dilucidar el mecanismo molecular involucrado en la regulación de HDAC2 por c-Abl. Nuestros resultados demostraron que c-Abl induce la fosforilación en tirosina de HDAC2, una modificación postraduccional que no había sido descrita para HDAC2 y que previene tanto la ubiquitinación como la degradación vía proteosoma de HDAC2. En conjunto nuestros hallazgos sugieren que la fosforilación en tirosina de HDAC2 es el mecanismo por el cual c-Abl incrementa los niveles de esta proteína.
También analizamos el efecto de Imatinib sobre el reclutamiento de HDAC2 en neuronas hipocampales tratadas con oligómeros de A\03B2. Interesantemente, Imatinib redujo el reclutamiento de HDAC2, inducido por oligómeros A\03B2, sobre los promotores de los genes sinápticos evaluados. Finalmente estudiamos el ratón transgénico APPswe/PSEN1\0394E9 un modelo de la EA, que presenta un incremento en los niveles de HDAC2. En este modelo el tratamiento intraperitoneal con Imatinib previene el incremento en los niveles de HDAC2, resultado que confirma in vivo el rol de c-Abl en el incremento de los niveles de HDAC2. En resumen, la activación de c-Abl incrementa los niveles de HDAC2 mediante la fosforilación en tirosina de esta proteína, lo que finalmente induce la represión en la expresión de genes neuronales. Así, nuestros resultados sugieren una nueva vía de señalización formada por c-Abl/HDAC2 que participa en la represión de genes neuronales en modelos de la EA; además propone a c-Abl como un blanco terapéutico para prevenir los efectos negativos producidos por la actividad de HDAC2 en EA.
Considerando estos antecedentes, la hipótesis de esta tesis es: \201CLa tirosina quinasa c-Abl incrementa los niveles de HDAC2 y regula la expresión de genes neuronales\201D Para probar nuestra hipótesis, modificamos la actividad de c-Abl utilizando distintos aproximaciones in vitro e in vivo y en ellos evaluamos los niveles y actividad de HDAC2. Primero evaluamos los niveles de HDAC2 en neuronas hipocampales expuestas a oligómeros de A\03B2, un modelo que presenta un incremento en la actividad de c-Abl. Interesantemente, el tratamiento con oligómeros de A\03B2 incrementa los niveles de HDAC2; y de forma concordante con nuestra hipótesis, el pre-tratamiento con Imatinib, un inhibidor de c-Abl, previene el incremento en los niveles de HDAC2. Además, para confirmar el rol de c-Abl en la regulación de los niveles de HDAC2, transfectamos células con el plásmido que expresa c-Abl o un shRNA en contra de c-Abl; mientras la sobrexpresión de c-Abl causa un incremento significativo en los niveles de HDAC2, la reducción de los niveles de c-Abl muestra una disminución significativa de los niveles de HDAC2. Posteriormente, evaluamos el rol de c-Abl en la regulación de la actividad como represor transcripcional de HDAC2. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con Imatinib y la transfección con el plásmido de expresión para Abl-KD (forma dominante negativa de c- Abl) reducen la actividad como represor transcripcional de HDAC2. Asimismo, la sobreexpresión de c-Abl incrementa la actividad como represor transcripcional de HDAC2. En conjunto nuestros resultados confirman el rol de c-Abl sobre la actividad como represor transcripcional de HDAC2.
Luego estudiamos mediante Inmunoprecipitación de Cromatina si c-Abl regula el reclutamiento de HDAC2 en los promotores de algunos genes sinápticos seleccionados. Los resultados demuestran que el tratamiento con Imatinib reduce el reclutamiento de HDAC2 en el promotor de los genes evaluados; además demuestra que esta reducción va acompañada por un incremento en el nivel de acetilación de la histona H3 en estos mismos promotores. Concordante con estos resultados, observamos que el tratamiento con Imatinib incrementa la expresión de los genes estudiados. En conjunto, nuestros resultados demuestran que c-Abl por medio de HDAC2 regula la expresión de genes neuronales. El próximo paso fue dilucidar el mecanismo molecular involucrado en la regulación de HDAC2 por c-Abl. Nuestros resultados demostraron que c-Abl induce la fosforilación en tirosina de HDAC2, una modificación postraduccional que no había sido descrita para HDAC2 y que previene tanto la ubiquitinación como la degradación vía proteosoma de HDAC2. En conjunto nuestros hallazgos sugieren que la fosforilación en tirosina de HDAC2 es el mecanismo por el cual c-Abl incrementa los niveles de esta proteína.
También analizamos el efecto de Imatinib sobre el reclutamiento de HDAC2 en neuronas hipocampales tratadas con oligómeros de A\03B2. Interesantemente, Imatinib redujo el reclutamiento de HDAC2, inducido por oligómeros A\03B2, sobre los promotores de los genes sinápticos evaluados. Finalmente estudiamos el ratón transgénico APPswe/PSEN1\0394E9 un modelo de la EA, que presenta un incremento en los niveles de HDAC2. En este modelo el tratamiento intraperitoneal con Imatinib previene el incremento en los niveles de HDAC2, resultado que confirma in vivo el rol de c-Abl en el incremento de los niveles de HDAC2. En resumen, la activación de c-Abl incrementa los niveles de HDAC2 mediante la fosforilación en tirosina de esta proteína, lo que finalmente induce la represión en la expresión de genes neuronales. Así, nuestros resultados sugieren una nueva vía de señalización formada por c-Abl/HDAC2 que participa en la represión de genes neuronales en modelos de la EA; además propone a c-Abl como un blanco terapéutico para prevenir los efectos negativos producidos por la actividad de HDAC2 en EA.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas, mención en Biología Celular y Molecular)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2014