3.06 Tesis doctorado

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El ácido palmítico reduce la sensibilidad a insulina de neuronas hipotalámicas: rol de la autofagia y del receptor FFAR1/GPR40
(2022) Toledo Valenzuela, Lilian Alejandra; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La diabetes mellitus tipo 2 es una compleja enfermedad metabólica caracterizada por una hiperglicemia crónica, que puede ser debida a una disminución en la sensibilidad a la insulina, a una reducción en su secreción o una combinación de ambas. El consumo de una dieta alta en grasas, abundante en ácido palmítico, favorece el desarrollo de esta enfermedad. El ácido palmítico disminuye la sensibilidad a la insulina en todo el organismo, incluyendo las neuronas hipotalámicas, que inhiben la producción de glucosa hepática (PGH) clave en la regulación de la glicemia. La acumulación hipotalámica de ácido palmítico reduce la supresión de la PGH, lo cual podría causar una menor sensibilidad a insulina en estos animales; sin embargo, esto aún no ha sido dilucidado. Respecto al mecanismo, se ha descrito que la activación por ácido palmítico del Receptor de Ácidos Grasos Libres 1 FFAR1/GPR40, disminuye la respuesta a la insulina en células β-pancreáticas, aunque no se ha evaluado si también reduce la sensibilidad a insulina en neuronas hipotalámicas, y si esto se traduce en una menor captación de glucosa mediada por insulina. Por otra parte, hemos demostrado que la autofagia, un proceso de degradación y reciclaje esencial para la homeostasis celular, se inhibe por la activación de FFAR1/GPR40 por ácido palmítico en neuronas hipotalámicas. La inhibición de la autofagia se asocia con una menor sensibilidad a la insulina en diversas células, por lo que resulta relevante evaluar si su bloqueo por ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. En base a la evidencia expuesta previamente, este proyecto está enfocado en determinar si el ácido palmítico, a través del receptor de ácidos grasos libres 1 (FFAR1/GPR40) y por medio de la inhibición de la autofagia, reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. Por otro lado, queremos determinar si la infusión intracerebroventricular (ICV) de ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en ratones C57BL/6. Nuestros resultados muestran que el ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina de las neuronas hipotalámicas por un mecanismo que incluye tanto la activación de FFAR1/GPR40 como defectos en la autofagia, reduciendo la activación de la vía PI3K/AKT y disminuyendo la captación de glucosa inducida por insulina en neuronas hipotalámicas. Finalmente, nuestros datos sugieren que la infusión hipotalámica de ácido palmítico reduce la tolerancia a la glucosa y disminuye los niveles plasmáticos de insulina en ratones C57BL/6. Este proyecto provee nueva información acerca de cómo el ácido palmítico favorece el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2, dando énfasis en la función de FFAR1/GPR40 en las neuronas hipotalámicas y considerando a la autofagia como un mecanismo de regulación de la sensibilidad a insulina en estas células. Estos resultados podrían ser un precedente para futuros estudios enfocados en el rol de la autofagia en neuronas hipotalámicas y su relevancia en la regulación de la glicemia.
Astrocytes from the retrotrapezoid nucleus drives chemoreceptor neuron hyper-responsiveness to hypercapnia in heart failure: role of oxidative stress and glutamate spill-over
(2024) Díaz Jara, Esteban; Río Troncoso, Rodrigo Andre del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La insuficiencia cardiaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una enfermedad crónica caracterizada por una alta prevalencia de desórdenes respiratorios e irregularidades en el patrón ventilatorio, las cuales están estrechamente asociados con la potenciación del quimiorreflejo central. El principal núcleo quimiorreceptor central es el núcleo retrotrapezoide (RTN), ubicado en la superficie del tronco encefálico, que contiene neuronas que frente a un estímulo hipercápnico propagan potenciales de acción excitatorios hacia los centros respiratorios, modulando el patrón respiratorio. En modelos preclínicos de ICFEP, la eliminación selectiva de las neuronas quimiorreceptoras del RTN normaliza la quimiorrefleja central y elimina la irregularidad en el patrón respiratorio. Sin embargo, los mecanismos celulares que potencian la función del RTN durante la ICFEP no se han estudiado previamente. En los últimos años, se ha demostrado que, además de las neuronas quimiorreceptoras, los astrocitos ubicados en el RTN desempeñan un papel clave en la regulación de la quimiorrecepción en condiciones normales. Sin embargo, se desconoce el rol de estas células en el control de la quimiorecepción central durante la ICFEP. Por lo tanto, propuse como hipótesis que "El estrés oxidativo aumenta el impulso del quimioreflejo central en la ICFEP al reducir la captación de glutamato mediada por los astrocitos en el núcleo retrotrapezoide". Los objetivos principales de esta tesis doctoral fueron: i) Determinar los niveles de estrés oxidativo y glutamato en el RTN y estudiar la contribución del estrés oxidativo en las respuestas exageradas del quimiorreflejo central en ratas con ICFEP; ii) Determinar las alteraciones en la morfología de los astrocitos y la localización y expresión del transportador de glutamato-1 (GLT-1) en el RTN de ratas con ICFEP; iii) Determinar la actividad neuronal en secciones del tronco encefálico que contienen el RTN de ratas con ICFEP; y iv) Determinar si la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de ratas con ICFEP restaura la respuesta normal de las neuronas quimiorreceptoras a la hipercapnia. La ICFEP fue inducida en ratas Sprague Dawley machos adultos (~250 g) mediante una fístula arteriovenosa. Se utilizó pletismografía de cuerpo entero para evaluar tanto la respuesta ventilatoria a la hipercapnia (FiCO2 7%), como el patrón respiratorio en reposo. Los niveles del anión superóxido y de superóxido dismutasa 2 en el RTN se determinaron por tinción con dihidroetidio (DHE) y Western Blot, respectivamente. La morfología de los astrocitos y los niveles de GLT-1 en el RTN se determinaron mediante inmunofluorescencia y RNAscope, respectivamente. La localización celular de SOD2 y de GLT-1 se realizó mediante análisis bioinformáticos. Los niveles de glutamato extracelular en el RTN se midieron en animales anestesiados, y posteriormente mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para evaluar la actividad de las neuronas quimiorreceptoras RTN, se realizaron inyecciones estereotáxicas de un adenovirus que permitió la expresión de un sensor de calcio citoplasmático (GCaMP6s) en las neuronas. Posteriormente se analizaron los cambios de fluorescencia en las secciones del tronco encefálico que contenían el RTN mediante microscopía confocal. Finalmente, la sobreexpresión de GLT-1 en astrocitos RTN fue realizada por la inyección estereotáxica de un adenovirus que permitió la expresión del transportador de glutamato-1 bajo el promotor específico de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los animales con ICFEP presentaron un aumento en los niveles del anión superóxido en el RTN, los cuales están estrechamente relacionados con la potenciación del quimiorreflejo central en animales ICFEP. El aumento de los niveles de superóxido en el RTN se asoció con la disminución en los niveles de expresión de SOD2, tanto a nivel de mRNA y proteína, en los animales con ICFEP. En paralelo, animales con una disminución parcial de SOD2 presentan un aumento en los niveles de superóxido en el RTN los cuales se correlacionan con la potenciación del quimiorreflejo central, similar a lo observado en animales con ICFEP. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que SOD2 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN en lugar de en las neuronas quimiorreceptoras. Las ratas con ICFEP presentan un aumento en los niveles de glutamato extracelular en el RTN tanto en condiciones basales como durante el estímulo hipercápnico comparado con animales Sham. Tanto las ratas con ICFEP como en animales con una disminución parcial de SOD2 presentan una disminución en la morfología de los astrocitos del RTN. Interesantemente se observó que los animales con ICFEP presentan una disminución en la tinción de NMB, el marcador de neuronas quimiorreceptoras del RTN. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que GLT-1 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN y no en las neuronas quimiorreceptoras, y que en los animales con ICFEP, existe una disminución en los niveles de GLT-1 en el RTN. Las neuronas quimiorreceptoras del RTN de animales con ICFEP presentan un aumento de actividad tanto en condiciones basales como al ser expuestas a un medio ácido. Finalmente, la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de animales con ICFEP normaliza la actividad de las neuronas quimiorreceptoras del RTN. Además, la sobreexpresión de GLT-1 normaliza los niveles extracelulares de glutamato en el RTN, el quimiorreflejo central y el patrón respiratorio en animales con ICFEP. Estos resultados sugieren que el aumento del estrés oxidativo y la disfunción de los astrocitos en el RTN juegan un rol clave en la potenciación del quimiorreflejo y en la progresión de la ICFEP, principalmente a través la recaptación del glutamato extracelular.
Aumento de proliferación y neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis en respuesta a la sobre expresión de Lin28
(2022) Herrera Rojas, Mauricio Alejandro; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En humanos un daño a la médula espinal se considera irreversible, sin embargo, existen animales con alta capacidad regenerativa tales como el pez cebra, el ajolote y la rana Xenopus laevis los cuales son capaces de regenerar la médula espinal después de un daño, recuperando las conexiones y movilidad perdida producto de la lesión. Para el estudio de la regeneración de la médula espinal, Xenopus laevis presenta ventajas que lo hacen un modelo único de estudio. En etapas pre-metamórficas es un animal con la capacidad de regenerar la médula, mientras que durante y después de la metamorfosis, este animal pierde esas capacidades, por lo que se transforma en un animal no regenerativo. Estudios de nuestro laboratorio utilizando a Xenopus laevissugieren que, para que ocurra regeneración de la médula espinal en estadios regenerativos, es necesario la activación de progenitores neurales identificados como células Sox2+. Al analizar los niveles de expresión de Sox2, se ha visto que estos disminuyen a medida que la rana avanza el desarrollo (metamorfosis). Por lo tanto, se determinó que la disminución de Sox2, podría ser una causa del porqué la rana pierde las capacidades regenerativas en estadios pre-metamórficos. La pregunta que surge en cuestión es ¿existe algún factor que pueda regular a los progenitores neurales Sox2+ y promover la neurogénesis para la regeneración de la médula espinal? Cimadamore en el 2013 demostró que la sobre expresión exógena de la proteína de unión a RNA Lin28 era suficiente para rescatar a los progenitores neuronales de un defecto proliferativo en los estadios más tempranos de la neurogénesis, asociados a la pérdida de Sox2. En el mismo año, el grupo de Shyh-Chang demostró que se mejoraba la regeneración acelerando el recrecimiento de cartílagos, huesos y tejido mesenquimal después de la amputación de los dígitos distales o la perforación de las orejas en los animales. Por último, una expresión constitutiva de Lin28 en células P19, causó un bloqueo completo de glicogénesis acompañado de un incremento en la neurogénesis. Estos antecedentes nos hacen pensar Lin28 podría ser un factor preponderante para inducir la regeneración en la médula espinal mediante la regulación de los progenitores neurales Sox2+. En base a esto, nosotros presentamos la siguiente hipótesis: La sobre expresión de Lin28 produce un aumento de proliferación celular y de la neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis. Nuestros resultados muestran que hay un aumento significativo de la proliferación de progenitores Sox2 en la médula espinal de la rana producto del daño y que a través de los métodos clásicos de estudio de la neurogénesis con la utilización de un marcador de neurona madura NeuN, se observó que existe neurogénesis en respuesta al daño en estadios regenerativos de Xenopus laevis, por lo tanto, la neurogénesis podría ser un posible mecanismo por el cual la rana puede regenerar la médula espinal después de una daño. Además, los ensayos de sobre expresión de Lin28a en estadios regenerativos demostraron que esta proteína de unión a RNA, regularía la proliferación celular aumentando la actividad de las células progenitoras e induciría la diferenciación celular hacia un fenotipo neuronal generando un aumento en la neurogénesis en la médula espinal en ausencia de daño. Por lo tanto, nosotros creemos Lin28a sería un buen candidato de estudio para la regeneración de la médula espinal de Xenopus laevis a través del aumento de la neurogénesis.
Control of motivation for palatable food by kappa opioid receptor signaling and the neuropeptide Orexin-A
(2023) Sandoval Caballero, Carolina Loreto; Pérez Leighton, Claudio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Eating is a motivated behavior that provides nutrients to allow life. Animals evolved to perceive food as a positive reinforcer, resulting in increased motivation for food when the animal is hungry and decreased motivation when it is satiated. Motivation evolved to seek and eat food in an environment of food scarcity; however, it can become maladaptive in an environment with plenty food access, favoring excessive eating, weight gain, and obesity. Understanding the neuronal mechanisms regulating food motivation could improve therapies against obesity.Opioids and the hypothalamic Orexin/Dynorphin neurons are part of the brain mechanisms that regulate food intake and motivation for food. Opioids bind mainly to three G-protein coupled receptors (kappa, mu, and delta), which are expressed in brain regions that regulate food intake and motivation. Still, the contribution of each opioid receptor to food intake and motivation for food is unclear. The Orexin/Dynorphin neurons co-release the excitatory neuropeptides Orexins (e.g., Orexin-A and Orexin-B) and the inhibitory opioids Dynorphin (e.g., Dynorphin-A 1-13) into different areas, including the Oxytocin neurons from the paraventricular hypothalamic nucleus. The effects of Orexin and Dynorphin peptides in eating behavior are brain-site specific. For example, in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 increases and Orexin-A decreases palatable food intake (i.e., tasty food, generally high in sugars and fats). Still, the opposite effect is observed in the ventral tegmental area. Dynorphin-A1-13 binds mainly to the kappa opioid receptor, which is expressed in the anorexigenic oxytocin neurons of the paraventricular hypothalamic nucleus; however, whether inhibition of oxytocin neurons is involved in the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 in the paraventricular hypothalamic nucleus is unknown. Also, in this brain region, Orexin-A blocks the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13. Still, it is unclear whether these effects are mediated by changes in motivation for palatable food and whether the endogenous kappa opioid receptor signaling in the paraventricular hypothalamic nucleus regulates motivation for food. We hypothesize that in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 signaling through the kappa opioid receptor promotes motivation for sucrose, and Orexin-A inhibits this behavior. We evaluated this hypothesis through four specific aims. [1] To determine through a meta-analysis the effects of kappa, mu, and delta opioid receptor ligands on food intake and motivation. We found that: (1) agonists increased food intake after central injections while antagonists decreased food intake after central and peripheral injections. (2) We did not find differences between the effects of opioid receptor ligands on standard rodent food intake after injections in the paraventricular hypothalamic nucleus compared to other brain sites. (3) Mu agonists had the strongest orexigenic effect compared to kappa and delta agonists, with the most significant effect on fat intake. (4) Whereas only centrally administered kappa antagonists reduce feeding, peripherally administered antagonists for all opioid receptor subtypes reduce feeding; (5) peripheral administration of antagonists decreases motivation for food regardless of food type. [2] To determine whether in the paraventricular hypothalamic nucleus signaling through kappa opioid receptor mediates the ability of Dynorphin-A1-13 to increase motivation for sucrose. We assessed motivation for sucrose using a progressive ratio schedule in which mice must perform work licks to obtain sucrose. After each sucrose reward obtention, there was a 20 sec time-out period in which licks were recorded, but sucrose could not be obtained. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to the vehicle: (1) bilateral administration of the kappa opioid antagonist nor-binaltorphimine increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work and time-out licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. These effects were also found after subcutaneous administration of nor-binaltorphimine. (2) Unilateral Dynorphin-A1-13 administration increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing time-out licks. (3) Bilateral Dynorphin-A1-13 administration did not change the time to obtain sucrose rewards. However, it strongly decreased sucrose work licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. Also, nor-binaltorphimine did not block Dynorphin-A1-13 effects. Finally, we could not downregulate the expression of the kappa opioid receptor in the paraventricular hypothalamic nucleus and thus, these effects in motivation for sucrose were not performed. [3] To determine whether oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus express the kappa opioid receptor and whether blocking the kappa opioid receptor activates Oxytocin neurons in this brain region. Published data demonstrated that the kappa opioid receptor is expressed in oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus. Thus, we assessed whether nor-binaltorphimine activates oxytocin neurons and decreases food intake in mice. We found that nor-binaltorphimine administration in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased cafeteria diet intake and abolished the negative correlation between the percentage of active caudal oxytocin neurons and cafeteria diet intake established after vehicle injection. [4] To determine whether activation of the kappa opioid receptor by Dynorphin-A1-13 and orexin receptors by Orexin-A in the paraventricular hypothalamic nucleus have opposing effects on motivation for sucrose. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to vehicle (1) Unilateral Orexin-A administration increased sucrose work and time-out licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing the time to obtain sucrose rewards and time-out licks. (2) Orexin-A decreases the demotivational effects of Dynorphin-A1-13.We conclude that signaling through orexin and opioid receptors modulates feeding behaviors and motivation for food. Those effects depend on variables including the dose and administration route of the drug, food tested, and circadian period in which the outcomes were measured. Dynorphin-A1-13 and nor-binaltorphimine in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased sucrose work licks, and Orexin-A blocked the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 over time. We reasoned that the demotivational effects of nor-binaltorphimine could involve the activation of anorexigenic oxytocin neurons, and the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 could be explained by their signaling through other receptors besides the kappa opioid receptor, such as Mu opioid receptor. We conclude that during the active phase of the mice, Orexin-A potentiates the orexigenic mechanisms that are naturally active in mice and increases locomotion and motivation. Consequently, the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 could not be detected because orexigenic mechanisms reached a ceiling effect. Thus, instead of promoting motivation for sucrose, Dynorphin-A1-13 prompts allodynia that decreases feeding and motivated behaviors.
Coupling cell communication and optogenetics: implementation of a light-inducible intercellular system in yeast
(2023) Rojas Jorquera, Vicente Alberto; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La comunicación celular es un fenómeno extendido en biología, permitiendo la transmisión de información acerca de las condiciones del entorno. Con el fin de entender cómo la comunicación celular modula procesos biológicos relevantes, diferentes sistemas sintéticos basados en inducción química han sido exitosamente desarrollados. En este trabajo, se acopló la comunicación celular y la optogenética en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La aproximación consiste en dos poblaciones conectadas por la producción dependiente de luz de la feromona factor-α en un tipo celular, que induce la expresión génica en el otro grupo de células. Después de la caracterización individual de tres variantes de ambas cepas, el sistema intercelular optogenético fue evaluado combinando las diferentes células bajo condiciones contrastantes de iluminación. Usando luciferasa como gen reportero, co-cultivos específicos a una proporción 1:1 muestran activación de la respuesta bajo luz azul constante, lo que no fue observado para las mismas mezclas crecidas en oscuridad. Entonces, el sistema fue evaluado en varias transiciones oscuridad/luz azul, donde el nivel de respuesta varia dependiendo del momento en el que la iluminación fue entregada. Además, la amplitud de la respuesta puede ser ajustada modificando la proporción inicial entre ambos tipos de cepa. También, células expresando todas las partes del circuito sintético se generaron para verificar si la separación de actividades biológicas mejora el rendimiento general del sistema. En ese contexto, el sistema de dos poblaciones mostró mayores veces de inducción en comparación con cepas autónomas. Esta exitosa implementación del sistema intercelular optogenético abrió la oportunidad de expandir el repertorio de las cepas de levadura involucradas variando componentes de la vía de señalización como reguladores negativos y promotores de respuesta a feromona. Así, se obtuvieron diversas versiones del sistema, que muestran un amplio rango de niveles de respuesta bajo regímenes de inducción por luz. En general, estos resultados demuestran que la información externa de la luz es propagada a través de una molécula de señalización difusible para modular la expresión génica en un sistema sintético de células microbianas, lo que pavimentará el camino para estudios que permitan el control optogenético de dinámicas a nivel de población.
Development of recombinant vaccines to prevent the disease caused by the respiratory viruses SARS-CoV-2, hMPV, and hRSV
(2022) Gálvez Arriagada, Nicolás Marcelo Salvador; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las infecciones respiratorias se encuentran entre las enfermedades más comunes en todo el mundo y el SARS-CoV-2, hRSV y hMPV son los principales virus que aumentan estas cifras. El SARS-CoV-2 es el agente viral responsable del COVID-19 y de la actual pandemia en curso en todo el mundo. Se han generado varias vacunas para enfrentar esta pandemia, pero se ha demostrado que la aparición de variantes de interés reduce la inmunidad inducida por la vacuna contra el SARS-CoV-2. El hMPV y el hRSV son las principales causas de infecciones agudas del tracto respiratorio inferior, con tasas significativas de morbilidad y mortalidad en poblaciones pediátricas y geriátricas, pero a pesar de su impacto en todo el mundo, hasta la fecha no se han aprobado vacunas contra estos dos virus. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) es la vacuna actualmente utilizada contra la Tuberculosis. Esta vacuna suele administrarse a recién nacidos y tiene perfiles de seguridad e inmunogenicidad ampliamente descritos. BCG promueve una polarización Th1 de células T CD4+, y se ha utilizado como vector para la expresión de antígenos heterólogos, con correlatos positivos de protección contra diferentes patógenos intracelulares. Esto condujo al uso de diferentes BCG recombinantes (rBCG) como vectores para la expresión de antígenos virales, con el fin de inducir respuestas inmunes polarizadas Th1 contra los virus correspondientes. Aquí se reporta el desarrollo y la caracterización de tres prototipos de vacunas rBCG diferentes. En primer lugar, se generó una cepa de rBCG que expresa la Nucleoproteína del SARS-CoV-2 (rBCG-N-SARS-CoV-2) y se evaluó su seguridad e inmunogenicidad. Se probaron esquemas de vacunación heterólogos para potenciar la respuesta inmunitaria provocada tras la vacunación. Esta vacuna demostró ser segura, detectándose importantes respuestas inmunitarias celulares y humorales, caracterizadas por la activación de células T CD4+ y CD8+, aumento de la secreción de citoquinas relacionadas con una respuesta Th1 y aumento de la secreción de anticuerpos anti-N-SARS-CoV-2. Estos datos sugieren que este prototipo de vacuna podría ser una plataforma eficaz para prevenir la enfermedad causada por el SARS-CoV-2 y ayudar a reducir el impacto de esta pandemia a nivel mundial. Se evaluaron la eficacia y la inmunogenicidad de una rBCG que expresa la fosfoproteína de hMPV (rBCG-P-hMPV) en un proceso buenas prácticas de manufactura (cGMP). La vacuna cGMP rBCG-P-hMPV fue segura e indujo una respuesta inmune humoral y celular protectora en ratones, como lo demuestra un menor número de cargas virales e infiltración de células en los pulmones, un aumento significativo en la activación de las células T, la secreción de citocinas proinflamatorias en su mayoría relacionadas con un perfil Th1, y la secreción de anticuerpos IgG e IgA contra hMPV. Estos resultados serán una piedra angular para la proyección de esta vacuna en ensayos clínicos con humanos. Reportes anteriores muestran que la inmunización con una cGMP rBCG que expresa la nucleoproteína del hRSV (rBCG-N-hRSV) protege contra este virus en ratones. En Chile se realizó un ensayo clínico fase 1 para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de esta vacuna. Las muestras obtenidas se utilizaron para caracterizar la respuesta inmunitaria provocada tras la vacunación. Se detectó una respuesta celular significativamente mayor en diferentes momentos, junto con mayores niveles de anticuerpos circulantes contra antígenos de Mycobacterium y hRSV. Estos resultados caracterizan aún más la respuesta inmune provocada en humanos por esta vacuna contra hRSV. El desarrollo y caracterización de todas estas vacunas serán datos valiosos para la generación de tratamientos profilácticos seguros y efectivos contra estos virus respiratorios, que posiblemente podrían ser administrados a la población pediátrica.
Disfunción vascular en HFpEF: rol de la señalización simpática en la remodelación y actividad vascular adversa
(2024) Saavedra Álvarez, Andrea Stephanie; Río, Rodrigo del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La falla cardíaca es un síndrome causado por anormalidades cardíacas estructurales y funcionales, dentro de sus fenotipos clínicos se encuentra la falla cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF), que se define por tener una fracción de eyección ventricular izquierda ³ 50% y representa el 50% de los pacientes con falla cardíaca. El riesgo de padecer HFpEF aumenta con la edad y se incrementa con factores de riesgo adicionales que incluyen la hipertensión, obesidad, diabetes y enfermedades arterial coronaria. Dentro de las anormalidades presentadas en HFpEF está la disfunción y remodelamiento ventricular izquierdo, anormal acoplamiento ventrículo-arterial, incompetencia cronotrópica y rigidez miocárdica. Entre los mecanismos claves asociados a la generación de estas irregularidades está la inflamación microvascular asociada al desarrollo de disfunción endotelial microvascular coronaria, otro mecanismo es la disfunción endotelial sistémica que afecta la microvasculatura, ambas asociadas a una disminución en la biodisponibilidad de óxido nitrico, impactando en la vasodilatación dependiente de endotelio en pequeñas arterias, lo cual es acompañado de incremento del colágeno miocárdico, reducción del radio capilar y elevado incremento del contenido de colágeno en el miocardio, que consecuentemente incrementa la rigidez ventricular izquierda de fin de diástole. La relevancia de la disfunción vascular es tal, que la disminución de la biodisponibilidad de óxido nitrico y estrés oxidativo en HFpEF ha demostrado ser fundamental en el estrés metabólico e hipertensivo. Por otra parte, la desregulación autonómica, presente en todas las patologías cardiovasculares, cumpliría un papel importante en HFpEF, ya que está presente en pacientes y se asociaba con mayor mortalidad. Sin embargo, no se conoce como el desbalance del sistema autónomo ncide en las alteraciones vasculares que ocurren en HFpEF. En base a estos antecedentes se propone la siguiente hipótesis “La disfunción vascular en HFpEF se asocia a remodelación anatómica de las arterias y cambios en la señalización adrenérgica en las arterias de ratones”. Esto se estudiará determinando: 1. El remodelamiento vascular aórtico en ratones HFpEF. 2. El estado de reactividad y función aórtica en ratones HFpEF. 3. La respuesta aórtica asociada a inducción simpática en ratones HFpEF y 4. La disminución de la inervación simpática en aorta de ratones HFpEF. La estrategia experimental involucro el uso de un modelo de ratón al cual se le indujo el estado de HFpEF, a partir de él se obtuvo la aorta abdominal la cual se procesó para evaluación histológica mediante tinción hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, la reactividad vascular se estudió con el uso de un miógrafo en el cual la aorta se montó y se sometió a diversos agentes vasoactivos como potasio, fenilefrina, acetilcolina, NG-nitro-L-arginina metil éster, prazosina (inhibidor de receptor a-adrenérgico) y propanolol (inhibidor de receptor b-adrenérgico). La inervación simpática se evaluó con la expresión relativa de tirosina hidroxilasa. Además, se estudió la expresión del a1 adrenoreceptor, a2 adrenoreceptor, b2 adrenoreceptor y b3 adrenoreceptor. Los resultados muestran cambios morfológicos en la aorta de ratón HFpEF, asociado a una disminución del diámetro arterial con aumento del grosor de las capas que conforman las paredes del vaso, la capa íntima y la media. La evaluación de fibrosis en el tejido aórtico indico un aumento de este parámetro en asociación con una disminución del contenido muscular de la capa media vascular, que se condice con una baja expresión de la actina del músculo liso. En la evaluación de la reactividad vascular la aorta de ratón HFpEF no exhibió cambios respecto al control frente a agentes vasoconstrictores como la fenilefrina, pero si frente a acetilcolina donde no presentó capacidad vaso relajante, la inhibición de a y b adrenoreceptores presentaron disminución importante en la vasoconstricción aórtica. En la evaluación de la regulación autonómica se observa una disminución de la expresión de tirosina hidroxilasa y de los adrenoreceptores evaluados. En conclusión, estos resultados sugieren que aorta de ratón HFpEF que representa la macrovasculatura arterial, presenta alteraciones morfológicas y funcionales que pueden contribuir al desarrollo u mantención de la disfunción vascular en HFpEF.
Estudio de las bases fisiológicas para el uso de microorganismos fotosintetizadores en la oxigenación de órganos
(2022) Ehrenfeld Aranda, Carolina; Boric P., Mauricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas. Departamento de Fisiología
El oxígeno es una molécula clave para la vida animal; tras ser captado de la atmósfera, es suministrado a cada célula del organismo a través de su transporte por el sistema circulatorio, proceso finamente regulado para suplir su demanda. Sin embargo, en ciertas condiciones patológicas existe un suministro insuficiente de oxígeno a los tejidos, lo que genera daño celular. Interesantemente, otras células en la naturaleza pueden producir oxígeno mediante fotosíntesis, por lo que se propuso estudiar la posibilidad de emplear estas células como agente terapéutico, actuando como una fuente alternativa de oxígeno al circular a través de la vasculatura. Este trabajo de tesis consiste en una serie de estudios básicos mediante enfoques in vitro, in vivo y ex vivo, para estudiar el uso intravascular de microorganismos fotosintetizadores, orientado hacia futuras estrategias terapéuticas. Se estudiaron características físicas de las microalgas fotosintetizadoras Chlamydomonas reinhardtii y se compararon con eritrocitos humanos, revelando que ambos tipos celulares exhiben tamaño y propiedades reológicas similares, lo que apoya que las microalgas puedan circular a través de la vasculatura. La perfusión sistémica de ratones con microalgas reveló que éstas se distribuyen dentro de la vasculatura a través de todo el organismo, y que permanecen viables dentro de los tejidos. Además, se evaluaron aspectos de biocompatibilidad in vitro, demostrando que las C. reinhardtii pueden ser co-cultivadas con células endoteliales, sin verse afectados el fenotipo morfológico endotelial ni la viabilidad de ambos tipos celulares. También se evaluó la respuesta in vivo a la inyección sistémica de microalgas en ratones, que no desencadenó efectos adversos ni una respuesta inflamatoria, ni tampoco se generó una respuesta de memoria inmunológica ante una segunda dosis. Finalmente, se estableció el modelo de perfusión de corazón aislado de rata, demostrando que es posible evaluar parámetros de función cardiaca en tiempo real, en respuesta a la perfusión con microalgas fotosintetizadoras. En conjunto, estos resultados entregan datos clave para apoyar la idea de emplear a organismos fotosintetizadores circulando por la vasculatura, como fuente de suministro de oxígeno. El establecimiento de estos “glóbulos verdes” o “clorocitos” representa un paso importante hacia el desarrollo de terapias novedosas para el tratamiento de patologías caracterizadas por un suministro insuficiente de oxígeno.
Estudio del rol biológico de la fructosa en células de cáncer prostático
(2022) Corro Acuña, Néstor Bastián; Godoy, Alejandro S.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El cáncer prostático (CaP) es uno de los cánceres de mayor prevalencia en hombres tanto en países occidentales desarrollados como en vías de desarrollo. Un número relevante de estudios epidemiológicos han vinculado la progresión del CaP de alto grado con el consumo de dietas altas en grasas, carbohidratos y obesidad. Para poder sostener la alta demanda por glucosa necesaria para alimentar sus altas tasas de proliferación, las células de cáncer sobreexpresan el transportador de glucosa 1 (GLUT-1). Dicha sobreexpresión ha sido utilizada como fundamento en técnicas de imagen como la tomografía por emisión de positrones (PET), utilizando moléculas como la fluorodesoxiglucosa (FDG) para detectar tumores primarios y metastásicos. Pero el PET-FDG ha mostrado una aplicabilidad clínica limitada al estadificar el CaP. Además, nuestro laboratorio ha reportado la sobreexpresión de transportadores GLUT-2, y 5 (ambos descritos como transportadores de fructosa), en células de CaP en desmedro de GLUT-1. La fructosa es una hexosa presente en alimentos procesados y su excesivo consumo ha sido vinculada a patologías como hígado graso no alcohólico, gota y síndrome metabólico, así como cáncer de mama, páncreas e intestinal, esbozando la posibilidad que fructosa podría dar el soporte proliferativo a las células de CaP en lugar de glucosa. Por lo tanto, la hipótesis de este trabajo doctoral es que “las células de cáncer prostático captan fructosa intrínsecamente y que dicho transporte incrementa características celulares asociadas tanto a capacidades proliferación como de agresividad tumoral con respecto a glucosa”. Para poder confirmar esta hipótesis, primero se evaluó in vitro la capacidad de fructosa en incidir en parámetros como la tasa de proliferación, la viabilidad celular y la capacidad migratoria/invasiva con respecto a glucosa en modelos celulares benignos y malignos de CaP. También estudiamos valores cinéticos del transporte de fructosa en líneas celulares malignas de CaP. Posteriormente evaluamos el crecimiento tumoral en modelos in vivo de xenotransplante de CaP expuestos a la incorporación de fructosa o glucosa en la dieta, así como describir la expresión de transportadores GLUTs de fructosa y glucosa en los tumores. Finalmente analizamos el efecto de la incubación con fructosa o glucosa por hasta 72 horas sobre los niveles de ATP intracelular (ATPi), lactato intracelular, y su impacto en los niveles relativos de algunas enzimas metabólicas de interés mediante qPCR. Los resultados demostraron que fructosa podía mantener tasas de proliferación y viabilidad comparables a glucosa y aunque no modifica capacidades migratorias, si incrementa la invasividad tumoral en modelos in vitro de CaP. Los estudios cinéticos describieron que las células de CaP poseen una afinidad de transporte por fructosa correspondiente a la descrita para GLUT-5, sugiriendo que es GLUT-5 quien media este transporte. Ensayos de knockdown de GLUT-5 mediante siRNA confirmaron esta observación. La adición de fructosa en el agua de beber incrementó el tamaño de los tumores de modelos murinos de xenotransplante derivados tanto de línea celulares de PC3 como muestras clínicas, mientras glucosa en el agua no incidió significativamente sobre el tamaño tumoral con respecto al control. El análisis inmunohistoquímico de los tumores postratamiento reportó aumentos en los niveles de expresión de GLUT-5, 9 en presencia de fructosa con respecto a glucosa y control. Los niveles de ATPi se vieron incrementados tanto con glucosa como con fructosa al cabo de 72 horas en células malignas de CaP, pero no en benignas. Los niveles de ATPi con fructosa fueron significativamente menores con respecto a glucosa. Por otra parte, los niveles de lactato intracelular en células cultivadas con fructosa en el medio presentaron una disminución significativa respecto al control, mientras glucosa incremento dicho valor, sugiriendo que los metabolitos están siendo desviados a otras vías metabólicas o que el transporte de lactato ha sido afectado por la incubación con fructosa. Finalmente, se analizaron los niveles relativos de mRNA de las enzimas metabólicas, encontrando la sobreexpresión de las enzimas HK-2, G6PDH y FASN en células LNCaP y DU145. La importancia de este estudio radica en demostrar que fructosa es una hexosa que puede alimentar a las células de CaP mediante GLUT-5, un transportador que se sobre expresa en células y tejidos malignos de CaP y que tiene potencial para sostener la proliferación y viabilidad celular maligna. Aunque el mecanismo por el cual esta potenciación no está aún descrito, nuestros datos sugieren que dicho mecanismo involucra el consumo de fructosa dietética, influye en metabolitos como ATP y lactato intracelular, y puede modular la actividad de algunas enzimas a nivel de transcrito, lo que demuestra que fructosa y su metabolismo en CaP tienen potencial de ser utilizados como blancos terapéuticos o biomarcadores en CaP.
Expression of heme oxygenase-1 in dendritic cells elicits T cell activation and confers protective immunity against HSV in an in vivo skin infection model
(2023) Tognarelli Torres, Eduardo Ignacio; González Muñoz, Pablo Alberto; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los virus herpes simple tipo 1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2) son altamente prevalentes en la población, en parte debido a su frecuente diseminación, aún desde individuos asintomáticos. La infección por HSV puede producir diversas manifestaciones clínicas incluyendo lesiones en piel, ceguera, o incluso encefalitis severa. Un aspecto importante de HSV es su capacidad para interferir con la viabilidad y función de células dendríticas (DC), células presentadoras de antígeno que inician y modulan la respuesta inmune en la interfase entre inmunidad innata y adaptativa. Una enzima del hospedero que participa en respuesta inducida frente a estrés es hemo oxigenasa-1 (HO-1), que se ha visto posee actividad antiviral contra HSV en células epiteliales y neuronales. En este estudio, buscamos evaluar si HO-1 puede modular positivamente la viabilidad de DCs y su función frente a la infección por HSV, lo cual podría ser clave para establecer inmunidad protectora contra estos virus. Nuestros hallazgos indican que HO-1 reduce la infección en DC por HSV-1 y HSV-2, y provee protección contra la muerte celular que inducen estos virus en estas células. La sobreexpresión de HO-1 en DCs no promueve un incremento de los marcadores de maduración y activación, por el contrario, aumentan la presencia de marcadores inhibitorios. Las DCs que expresan HO-1 y están infectadas con HSV, en ensayos de co-cultivo activaron células T CD4 vírgenes hacia fenotipos T regulador (Treg), determinado por la expresión de FoxP3 y OX40, y T helper (Th17) por la secreción de IL-17. La mejora de la función de DCs producto de la expresión de HO-1 se debería a un defecto en el ciclo de replicación de HSV por una disminución en la liberación de partículas infecciosas desde DCs, sin causar un efecto sobre la replicación del genoma y síntesis proteica viral. En un modelo de encefalitis, la transferencia de DCs que expresan HO-1 e infectadas con HSV causó que los animales susceptibles sufrieran un adelanto y aumento de la severidad de la patología. Mientras que, en un modelo de infección en piel, la transferencia de estas DCs demoró el inicio de la enfermedad y redujo el puntaje clínico de la infección por HSV. Adicionalmente, la inducción por HO-1 promueve la migración de DCs a linfonodos popliteos (pLNs) y estimuló células T CD4 Th17 y Tregs. Finalmente, se encontraron en lesiones de piel células Th17, mientras que hubo presencia de T CD8 y Treg a tiempos tempranos y tardíos, respectivamente. Estos resultados sugieren que la expresión de HO-1 en DCs promueve control viral, junto con una respuesta antinflamatoria contra HSV que puede proveer protección en un modelo animal de infección.
Functional characterization of Lipophorin Receptors in the mushroom body of Drosophila melanogaster
(2022) Rojo Cortés, Francisca Rayén; Marzolo Canales, María Paz; Campusano Astorga, Jorge Mauricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los receptores de lipoforina de Drosophila melanogaster (LpRs), LpR1 y LpR2, median la captación de lípidos. Los ortólogos de estos receptores en vertebrados, ApoER2 y VLDL-R, se unen a Reelina, la que no está presente en las moscas. Estas proteínas están asociadas con el desarrollo y función del hipocampo y la corteza cerebral. Actualmente se desconoce si los LpRs desempeñan funciones similares en el cerebro de Drosophila. Informamos que las moscas deficientes en LpRs exhiben una memoria olfativa y patrones de sueño alterados, los que parecen reflejar los defectos anatómicos encontrados en un área de asociación cerebral crítica, el cuerpo fungiforme (MB). Además, las neuronas del MB respondieron a Reelina aumentando su árbol neurítico. Este efecto depende de LpRs y Dab, el ortólogo en Drosophila de la proteína adaptadora del la señalización de Reelina Dab1. In vitro, dos isoformas largas de LpRs permitieron la internalización de Reelina. Además, se estudió la proteína no caracterizada anteriormente, la que dada su similitud con F-spondina y Reelina llamaremos Drospondina, como un posible ligando endógeno para los LpRs. Drospondina es expresada por una población de glía a lo largo del desarrollo. Dado que se encontró Drospondina rodeando los lóbulos del MB, estudiamos el MB de moscas deficientes para Drospondin, encontrándose defectos en su desarrollo. Además, la falta de Drospondina alteró la homeostasis del sueño. También encontramos que Drospondina interactúa genéticamente con los LpRs. Estos hallazgos demuestran que LpRs, Dab y Drospondina contribuyen al desarrollo y la función de MB, lo que respalda la existencia de señalización dependiente de estas proteínas en Drosophila.
Mecanosensibilidad en linfocitos B: rol en la dinámica y funcionalidad de lisosomas durante la sinapsis inmunológica
(2023) Valle Batalla, Felipe Andrés del; Yuseff Sepúlveda, María Isabel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El estudio de la mecanosensibilidad celular representa una rama de la biología que recientemente ha ganado mucho interés, reflejado en el premio Nobel de fisiología y medicina de 2021 otorgado a Ardem Patapoutian por el descubrimiento y caracterización del mecano-receptor PIEZO1. Sin embargo, poco se ha estudiado sobre cómo las señales mecánicas provenientes del entorno extracelular pueden dictar el funcionamiento del sistema inmune, y en particular, de los linfocitos B: las únicas células capaces de producir anticuerpos. En este trabajo se estudió cómo las propiedades físicas de la superficie presentadora de antígenos influyen en la capacidad de las células B para extraer antígenos inmovilizados y cómo estos procesos están conectados. Se encontró que, al interactuar con sustratos más rígidos, las células B experimentan respuestas de estiramiento celular aumentadas y mayor acetilación de tubulina, específicamente en el centro de la sinapsis inmunológica. En sustratos rígidos, los lisosomas se ubican en el centro de la sinapsis, lo que reduce su movilidad en comparación con sustratos más blandos. Los lisosomas además muestran una preferencia por asociarse con tubulina acetilada en contextos de mayor rigidez. Mecanísticamente, esto implica la translocación de ATAT1, una enzima acetilasa de microtúbulos, del núcleo al citoplasma de las células B, actuando como señal mecánica durante la estimulación del BCR. El silenciamiento de ATAT1 en células B disminuye su capacidad para estabilizar los lisosomas en la interfaz sináptica, lo que resulta en una extracción y presentación reducidas de antígenos inmovilizados a las células T. Estos hallazgos sugieren una vía que conecta la extracción de antígenos con señales mecánicas provenientes de células presentadoras de antígenos. En resumen, esta investigación aporta nuevos conocimientos y ofrece una base para comprender mejor las respuestas inmunológicas, con posibles implicaciones en terapias y trastornos inmunológicos.
Modulación de la capacidad de invasión y adquisición de un fenotipo tipo endotelial en células del trofoblasto extravelloso: rol de la autofagia y las LDL oxidadas
(2023) Carvajal Rios, Lorena Paz; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La placenta es un órgano temporal que se desarrolla a través de procesos celulares dinámicos en condiciones fisiológicas de estrés. En este contexto, se ha descrito que la autofagia, podría ser necesaria para el proceso de placentación. Sin embargo, si la activación de autofagia representa una reacción adaptativa, o como la modulación de autofagia puede afectar la capacidad de invasión y diferenciación de los trofoblastos extravellosos (EVT), aún no se ha descrito en detalle. Debido a la importancia que estos fenómenos tienen para un embarazo exitoso, el estudio de como la autofagia podría regularlos, así como también el estudio de elementos que actúen como reguladores de ella como las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (ox-LDL), podría contribuir a comprender de mejor forma eventos asociados a complicaciones del embarazo relacionadas al desarrollo anormal de la placenta, como la preeclampsia (PE). Por esto, las hipótesis de esta tesis son: 1) Los niveles elevados de ox-LDL aumentan el flujo autofágico en un modelo celular de trofoblasto extravelloso, disminuyendo la capacidad de invasión y de diferenciación hacia un fenotipo con características endoteliales en estas células y 2) Los niveles de ox-LDL y de marcadores del flujo autofágico aumentan en placentas de término de embarazos humanos con preeclampsia comparado con embarazos fisiológicos. Para evaluar las hipótesis, nuestros objetivos fueron: (1) Determinar el efecto de la modulación de la autofagia sobre los procesos de invasión y de diferenciación hacia un fenotipo con características endoteliales en una línea celular de trofoblastos de primer trimestre. (2) Determinar el efecto de ox-LDL sobre la modulación de la autofagia y los procesos de invasión y de diferenciación hacia fenotipo con características endoteliales en una línea celular de trofoblastos extravellosos de primer trimestre y (3) Determinar los niveles de marcadores de flujo autofágico y la abundancia de ox- LDL en muestras de plasma materno y/o placentas de embarazadas controles y con preeclampsia, así como también el/los tipos celulares en los que ocurren los cambios en estos marcadores. Realizamos los ensayos de invasión y diferenciación utilizando la línea celular de trofoblastos extravellosos de primer trimestre HTR8/Svneo y determinamos que al inhibir autofagia no hay cambios en la invasión; sin embargo, al evaluar la formación de estructuras reticulares en los ensayos de diferenciación hacia un fenotipo con características endoteliales, se determinó una disminución en la capacidad de formar redes. A continuación, determinamos que al activar autofagia hay una disminución de la invasión, no obstante, no hay cambios en la capacidad de formar redes. En conjunto estos resultados nos indican que para un adecuado remodelamiento vascular se requeriría de una autofagia basal activa. Luego, determinamos el efecto de ox-LDL en estos procesos y se observó una disminución significativa de la invasión y de la capacidad de formar redes en el ensayo de diferenciación, sin cambios en el flujo autofágico, por lo que podríamos sugerir que las ox-LDL tendrían un rol en la regulación del proceso de placentación independiente de la autofagia. De forma interesante, en placentas de tercer trimestre con preeclampsia moderada observamos una disminución significativa en los niveles de ox-LDL al comparar con placentas control, sin cambios en preeclampsia severa. En estas placentas, no se determinaron cambios en marcadores de autofagia comparado con placentas de embarazos controles. En conclusión, las ox-LDL en modelo de EVT disminuyen el proceso de invasión y la capacidad de formar redes, sin embargo, no tienen efecto sobre el proceso de autofagia. Por otra parte, la capacidad de formar redes requiere autofagia basal activa. Es así como, tanto la modulación de autofagia como la exposición a ox-LDL en las células del trofoblasto extravelloso disminuirían el proceso de placentación a través de dos mecanismos independientes, lo que no se observa en placentas al término del embarazo.
OCRL1 Regulates the endocytic trafficking of APOER2 and reelin signaling
(2024) Fuentealba Perez, Luz Maria; Marzolo Canales, Maria Paz; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Bológicas
Lowe Syndrome is a severe disorder characterized by renal, ocular, and neurological signs. Mutations in the gene encoding the OCRL1 phosphatase are recognized as responsible for this syndrome. OCRL1 targets membrane phospholipids called phosphoinositides, with PI(4,5)P2 being the most common. The functions of OCRL1 are therefore associated with the regulation of intracellular trafficking and protein sorting. Mutations in OCRL1 affect different domains of the protein, both in enzymatic activity and in protein-binding domains, making it very difficult to describe a specific mechanism to explain this syndrome. Little is known about the nervous system, but neurological problems such as intellectual disability, behavioral disorders, and in some cases repetitive and stereotyped behaviors have been described. Interestingly, Reelin has functions in the development of the central nervous system, memory, and learning, and it signals by binding to membrane receptors of the LRP family, such as ApoER2/LRP8 and VLDLR, with ApoER2 being the most relevant. ApoER2 is internalized and recycled, and its intracellular trafficking is important for its function, as inhibiting its recycling significantly reduces Reelin signaling. Therefore, our study aims to elucidate whether the effects of OCRL1 on ApoER2 trafficking are reflected in a disturbance in Reelin signaling and, with this, to explain part of the neurological damage that occurs in Lowe Syndrome. Here, we show that ApoER2 passes through OCRL1-positive compartments and, furthermore, that the absence of OCRL1 disrupts the normal trafficking of ApoER2, affecting its availability at the cell surface and decreasing its half-life. Moreover, we detected a dysfunction in the signaling triggered by Reelin in our LS neuronal model. Thus, our study suggests that the disruption of the ApoER2/Reelin signaling pathway due to OCRL1 dysfunction may be a contributing factor to the neurological manifestations observed in Lowe Syndrome patients.
Participación de los canales TRPC-ORAI activados por STIM (STOC) en la hipertensión pulmonar inducida por hipoxia intermitente crónica
(2022) Castillo Galán, Sebastián; Iturriaga Agüera, Rodrigo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La apnea obstructiva del sueño (AOS), un trastorno de la respiración durante el sueño caracterizado por la hipoxia intermitente (CIH), se asocia con hipertensión sistémica y pulmonar (HP). Se ha demostrado que la hipoxia crónica induce HP mediante un aumento del estrés oxidativo (ROS) y la entrada de calcio a nivel pulmonar aumentada por los canales TRPC-ORAI activados por STIM (STOC). Sin embargo, se desconoce el rol de estos mediadores en el desarrollo de la HP inducida por exposición a CIH. En este trabajo propusimos que “La CIH produce un aumento de los niveles de los canales STOC, los cuales contribuyen a al remodelamiento vascular y al desarrollo de HP, siendo un mecanismo independiente del estrés oxidativo”. Se evidenció que la exposición de ratas durante 14-28 días a CIH gatilló un aumento progresivo del remodelamiento vascular y de la presión ventricular sistólica-derecha (RVSP) a partir del día 21. La expresión de STOC aumentó en paralelo con los cambios morfológicos y funcionales. La administración de 2-APB, un bloqueador de los STOC, previno totalmente el desarrollo de la HP y el aumento de los canales STOC, sin modificar los niveles de ROS a nivel sistémico y pulmonar. La administración de TEMPOL, un antioxidante, previno parcialmente el desarrollo de la HP y el aumento de los canales STOC, reduciendo solo el estrés oxidativo a nivel sistémico. Los resultados sugieren que los STOC juegan un papel clave en el desarrollo de la HP inducida por CIH, mediante un mecanismo independiente a ROS.
Rol de Exo70 en el tráfico polarizado de proteínas asociadas a la migración de linfocitos B
(2023) Goles Varela, Nicolás Ignacio; Yuseff Sepúlveda, María Isabel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los linfocitos B son células fundamentales del sistema inmune adaptativo, donde su desarrollo, maduración y activación están estrechamente ligados a su capacidad migratoria. La migración celular depende de una distribución asimétrica de moléculas de señalización, factores que promueven la remodelación del citoesqueleto de actina, como Arp2/3. Estudios de los mecanismos de tráfico intracelular asociados a migración han identificado que el exocisto, un complejo compuesto por 8 proteínas inicialmente descrito como regulador de la secreción y tráfico vesicular, tiene un importante rol en migración celular. En esta tesis evaluamos el rol de una proteína que forma parte del complejo exocisto, Exo70, y su relación con la migración de los linfocitos B, que hasta ahora no había sido explorado en estas células. Para abordar este estudio sometimos una línea celular de linfocitos B a ensayos funcionales de migración 2D y 3D donde encontramos que la migración de estas células depende de Exo70 mas no de otra subunidad del exocisto, Sec8. Adicionalmente evaluamos el ensamblaje del complejo y la ubicación subcelular de Exo70 en respuesta al estímulo migratorio. Por último, determinamos que Exo70 es fosforilado río abajo de la señal del receptor del estímulo migratorio y mostramos cómo esta promueve la interacción física de Exo70 con el complejo de ramificación de filamentos de actina Arp2/3. En esta tesis mostramos que Exo70 tiene un rol en la migración de linfocitos B, proceso fundamental para la búsqueda de antígenos, activación y posterior maduración de este tipo celular.
Rol de la E3 ligasa NEDD4-1 en la regulación de Mitofagia en células miogénicas
Salas Venegas, Jeremy Antonio; Olguín Marín, Hugo César; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El músculo esquelético de los vertebrados cuenta con la capacidad de regenerarse tras sufrir un daño, gracias a una pequeña población de células troncales musculares conocidas como células satélite (CS), las cuales se mantienen en un estado quiescente o de reposo proliferativo. El daño muscular desencadena distintos eventos, incluyendo la liberación de señales que activan a las CS, induciendo la entrada al ciclo celular y proliferación, generando células hijas, las cuales irán a reparar una fibra dañada o formar una fibra muscular de novo. Parte de las CS activadas escapan del proceso de diferenciación celular, recuperando el estado troncal, permitiendo la renovación de la población de CS quiescentes. En este contexto, PAX7 ha sido descrito como un factor de transcripción fundamental para la función de las CS, ya que su expresión promueve la mantención/readquisición del estado troncal, mientras que la reducción de sus niveles proteicos, permite la progresión miogénica y diferenciación terminal. La ubiquitin ligasa NEDD4-1 es capaz de ubiquitinar a PAX7, promoviendo su degradación vía proteosoma. Otros blancos moleculares de NEDD4-1 han sido descritos en diversos procesos celulares, más su función en distintas vías asociadas a la regeneración muscular ha sido poco explorada. Recientemente se ha descrito que la autofagia favorece la regeneración muscular promoviendo la mantención de la troncalidad de las CS y la diferenciación de mioblastos a miotubos y miofibras. Investigaciones previas muestran que el silenciamiento de la expresión de NEDD4-1 inhibe el flujo autofágico a través de la desregulación de los niveles de p62 y LC3, proteínas claves en la selección de cargos y formación de los autofagosomas, respectivamente. Además, el silenciamiento de NEDD4-1 resulta en la acumulación de mitocondrias con formas aberrantes. Estas observaciones sugieren que NEDD4-1 podría tener funciones más complejas durante la progresión miogénica, ya que además de participar en la regulación de la troncalidad de las CS, podría participar en el control de la autofagia general o específica (ej. mitofagia). En base a estos antecedentes, en esta tesis doctoral se buscó entender cómo NEDD4-1 participa de la regulación de la mitofagia en células miogénicas, en el marco de los procesos de proliferación y diferenciación miogénica, junto a la regeneración muscular. Las estrategias experimentales principales que fueron utilizadas son: i) la pérdida de función de NEDD4-1 y ii) la modulación farmacológica de la autofagia. Metodológicamente, i) se abordó in vitro mediante silenciamiento (siRNA) e in vivo mediante un modelo de recombinación genética célula-específica; ii) se abordó principalmente in vitro (cultivos celulares). Tanto en i) como en ii) se midieron marcadores de regeneración (PAX7,MYOG,MHC), autofagia (LC3,p62) y masa mitocondrial (mtHSP70). Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral indican que la ausencia de NEDD4-1 resulta en una regeneración muscular deficiente y la caída en marcadores miogénicos claves en el proceso regenerativo, a su vez se observa una población mitocondrial con fenotipo fragmentado, una caída de los niveles de marcadores de masa mitocondrial y de flujo autofágico. Estos resultados apoyan la hipótesis de que NEDD4-1 es una proteína importante dentro de la regulación de la homeostasis mitocondrial y flujo autofágico, ambos procesos que han sido demostrados como fundamentales para una correcta regeneración muscular.
Rol del receptor de KDEL en la formación y función de la sinapsis inmune en Linfocitos B
(2022) Fuentes Peña, Danitza Natalia; Yuseff Sepúlveda, María Isabel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La interacción de los linfocitos B con los antígenos inmovilizados desencadena la formación de una sinapsis inmune (SI), caracterizada por un fenotipo polarizado que involucra un remodelamiento dinámico del citoesqueleto de actina, así como el reclutamiento del centrosoma y lisosomas al sitio de encuentro del antígeno. La participación y el procesamiento de antígenos en los linfocitos B aumentan la biosíntesis y el transporte de moléculas de MHC-II desde el retículo endoplásmico (RE) al aparato de Golgi. Datos de nuestro laboratorio señalan que el aparato de Golgi se localiza de cerca al IS tras la activación, sugiriendo que las proteínas de esta vía se concentran y liberan en este dominio de la SI. Una mayor demanda de la vía secretora genera un desequilibrio entre el RE y el Golgi, el cual es resuelto por el receptor de KDEL (KDELR), que permite la recuperación de proteínas del Golgi al RE. El tráfico del KDELR está asociado a la señalización rio abajo de quinasas de la familia Src, que además activan proteínas como Arp2/3 para promover la polimerización de actina. Las mutaciones en KDELR generan linfopenia y alteran el desarrollo de las células B y la activación de las células T, lo que sugiere que KDELR podría regular la formación y función del IS en las células B para promover su activación eficiente. Para probar esta hipótesis, proponemos estudiar el papel del KDELR en la remodelación del citoesqueleto de actina, la captura de antígenos, su procesamiento y presentación por los linfocitos B.Nuestros resultados muestran que tras la activación de las células B, el KDELR cambia su localización del Golgi al ER. Los linfocito B silenciados para el KDELR o que expresan una mutación del receptor muestran una remodelación citoesquelética de actina alterada en el IS, como se destaca por los defectos en su capacidad de estiramiento de membrana en respuesta al antígeno inmovilizado. Además, estas células muestran defectos en la polarización de lisosomas al IS, lo que conduce a una extracción y presentación deficiente de antígenos inmovilizados.En conclusión, KDELR controla la formación de SI regulando el remodelamiento y estiramiento de la membrana sináptica dependiente del citoesqueleto de actina, promoviendo el reclutamiento estable de lisosomas para facilitar la extracción del antígeno. Nuestros resultados destacan una novedoso mecanismo celular sobre cómo los cambios en la vía secretora se acoplan a la formación de SI durante la activación de los linfocitos B.
Role of Abl1 kinase in axon initial segment disassembly and its consequences on axonal trafficking in Alzheimer’s disease.
(2024) Stuardo Castillo, Nicolás Gabriel; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Axon initial segment disassembly has recently begun to be appreciated as an important event in Alzheimer’s disease pathology as it directly impacts neuronal compartmentalization, leading to pathological processes like tau missorting. However, the molecular mechanisms that underlie the collapse of the axon initial segment scaffold are incompletely understood. Our lab has previously shown that Abl1 kinase, a non-receptor tyrosine kinase with multiple functions, becomes aberrantly activated in Alzheimer’s disease and promotes multiple deleterious cellular processes including dendritic spine collapse, tau hyperphosphorylation, neuronal apoptosis, among others. Given the important role of Abl1 in Alzheimer’s disease pathology and its emerging role in tau pathology, we set out to evaluate whether it could participate directly in axon initial segment collapse. Our results show that inhibition of Abl1 prevents amyloid-β fibril–promoted axon initial segment collapse, and conversely, that Abl1 allosteric activation promotes loss of Ankyrin G clustering. Through cytosolic extraction experiments, we show that active Abl1 associates to the axon initial segment scaffold, and that this association increases in response to amyloid-β fibril treatment. Furthermore, through expansion microscopy experiments we show that Abl1 can be found in the axon initial segment in vivo and in vitro. We then evaluated the effects of Abl1 activation on the axon initial segment actin cytoskeleton and found that it promotes a decrease in actin patch area and a generalized decrease in phalloidin stain intensity. In order to further our understanding of the underlying molecular mechanism, we evaluated the participation of MICAL3, a known AIS actin patch depolymerizing protein and Abl1 interactor, in the process of actin patch loss. Interestingly, we find that Abl1 appears to recruit MICAL3 to actin patches and that silencing MICAL3 expression with a shRNA precludes the actin patch disassembly induced by Abl1 activation, shedding light on a possible mechanism of AIS actin cytoskeleton disruption by Abl1. Finally, we evaluated 2 different cargoes that have been previously shown to depend on axon initial segment integrity for its correct compartmentalization: Rab11, a somatodendritic protein, and tau, an axonal protein. Strikingly, we find that Rab11 missorts into the axon, and tau missorts into the somatodendritic compartment in response to Abl1 activation, demonstrating a bidirectional failure in AIS barrier function. Taken together, our results show that Abl1 plays an important role in AIS destabilization and that this has important consequences in terms of protein compartmentalization, which are relevant processes in Alzheimer’s disease pathology.
Role of the ATX / LPA / LPARS axis in the fibrotic response of skeletal muscle
(2022) Córdova Casanova, Adriana Paz; Brandan, Enrique; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Fibrosis se define como la acumulación excesiva de componentes de la matriz extracelular (MEC), y es una característica de diversas enfermedades crónicas. En esta situación patológica se reemplaza el tejido normal por MEC y existe una pérdida progresiva de la funcionalidad del tejido u órgano involucrado. Dentro de las patologías que conducen al desarrollo de fibrosis en el músculo esquelético se encuentran las distrofias musculares. Actualmente numerosos trabajos indican que la reducción de la fibrosis del músculo esquelético se asocia a una ganancia de la función y fuerza lo cual cobra relevancia terapéutica. A lo largo de los años se ha enfatizado en el estudio de factores proteicos como elementos gatillantes de fibrosis. No obstante, recientemente se ha correlacionado el desarrollo de fibrosis en distintos órganos/tejidos con la producción incrementada de ácido lisofosfatídico (LPA), un lisofosfolípido que señaliza a través de 6 receptores (LPARs, LPA1-6). El LPA es sintetizado principalmente por la enzima autotaxina (ATX) y degradado por fosfatasas de fosfato de lípidos (LPP). El tratamiento con antagonistas específicos de LPA1 y LPA3 previene la inducción de fibrosis dermal, pulmonar y renal en distintos modelos murinos. En su conjunto, estos antecedentes sugieren que LPA y sus receptores participan activamente de procesos fibróticos en diversos órganos. Resultados preliminares de nuestro laboratorio indican que el LPA puede inducir la expresión de del Factor 2 de Red de Comunicación Celular, CCN2, también llamado Factor de Crecimiento del Tejido Conectivo (CTGF) en mioblastos. CCN2 es una proteína matricelular pro-fibrótica, la cual está aumentada en el músculo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD) y en el ratón mdx, siendo este último el modelo más estudiado de la DMD. CCN2 también se encuentra incrementado el musculo de ratones deficientes para Sgcd (Sgcd-KO), modelo de distrofia muscular de cinturas (LGMD) y en el modelo de denervación muscular, los cuales conllevan el desarrollo de fibrosis. Experimentos de ganancia de función indican que la sobreexpresión de CCN2 en músculo esquelético de ratones wild type (WT) determina un incremento en marcadores de fibrosis como fibronectina, decorina y α-SMA, junto a una pérdida en fuerza muscular. Por otra parte, experimentos de pérdida de función indican que la disminución de la fibrosis muscular en ratones mdx que presentan una deleción hemicigota para CCN2, (mdx/Ctgf+/-) y ratones mdx tratados con un anticuerpo neutralizante contra CCN2 (FG3019/Pamrevlumab) mejoran el fenotipo distrófico, la fuerza muscular y la función locomotora. Similares hallazgos en la disminución de la fibrosis por la inhibición de CCN2 se han observado en músculo de ratones denervados o en un modelo animal para esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Por los antecedentes mencionados, esta tesis se encuentra focalizada en el estudio del rol que cumple el LPA en la fibrosis del músculo esquelético y en particular, en la expresión de CCN2. En esta tesis demostramos que existe expresión de los receptores de LPA en el músculo esquelético y en progenitores fibro/adipogénicos (FAPs), células capaces de dar origen a miofibroblastos y responsables en gran medida de la síntesis de MEC. Además, demostramos que tanto el LPA como el agonista específico de LPA3, 2s-OMPT, inducen CCN2 en cultivo primario de progenitores FAPs y que la activación de AKT, ERK y JNK podrían estar participando en la inducción de este importante factor pro-fibrótico. Además, se determinó que existen niveles alterados de los LPARs en músculos fibróticos, indicando un posible aumento de la sensibilidad y respuesta del músculo a LPA en ese contexto patológico. Así mismo, demostramos que el músculo esquelético es capaz de responder al estímulo de LPA induciendo CCN2 y moléculas de la MEC como fibronectina y colágeno. Se determinó también que el LPA induce un aumento significativo en el número de FAPs en el músculo y se estudió la participación del eje ATX / LPA / LPARs, en la fibrosis inducida por denervación a través de experimentos de pérdida de función de los LPA1 y LPA3, utilizando antagonistas y un modelo deficiente para LPA1 (LPA1-KO), donde encontramos disminución de marcadores fibróticos a las 2 semanas de denervación muscular. Los resultados de esta tesis nos permiten concluir que el músculo esquelético y los FAPs expresan LPARs y que estos son capaces de responder a su estímulo induciendo una respuesta fibrótica, Así mismo, demostramos que el eje ATX / LPA / LPARs participa directamente en la inducción de la fibrosis en el modelo de denervación muscular. Nuestros resultados proveen información relevante para iniciar pruebas experimentales en modelos animales distróficos bloqueando el eje ATX / LPA / LPAR como un paso necesario en la búsqueda de nuevas herramientas terapéuticas en pacientes con distrofias musculares.

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