Determinación del crosstalk estructural entre los receptores de membrana 5-HT3a y P2X4 mediante microscopía de fuerza atómica.
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Date
2020
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Abstract
Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos
activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista
fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y
periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores
es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades
neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional
entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden
interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto
depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con
pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA
respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por
inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5-
HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría.
Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de
ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio
la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas
con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó
que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es
inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4,
inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo.
Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física,
probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas.
Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de
receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk
estructural entre receptores ionotrópicos.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas con mención en Ciencias Fisiológicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2020