3.02 Tesis doctorado

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Adolescent cannabinoid exposure increases nigrostriatal dopaminergic transmission.
(2019) Pérez Valenzuela, Enzo Javier; Fuentealba Evans, José Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Evidencia sugiere una relación entre el uso de cannabinoides en adolescentes y trastornos psiquiátricos, caracterizados por alteraciones en sistemas dopaminérgicas, como esquizofrenia y adicción a drogas en la adultez. Sin embargo, el impacto de la exposición a cannabinoides en la adolescencia en la vía dopaminérgica nigroestriatal en adultos no está completamente dilucidado. El objetivo es estudiar efecto del agonismo CB1/2 en la adolescencia sobre la dinámica dopaminérgica en el estriadodorsolateral en la adultez. Para esto se administró repetidamente un agonista CB1/2 en ratas adolescentes, se determinó el impacto en la transmisión dopaminérgica nigroestriatal mediante experimentos de microdiálisis y registro electrofisiológico en ratas adultas. Ambas mediciones muestran que la activación repetida de los receptores CB1/2 incrementan el tono dopaminérgico en la vía nigroestriatal. Interesantemente, la activación del pálido ventral (VP) atenuó el dicho incremento en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra par compacta inducida por la exposición a cannabinoides en adolescentes. Estos resultados indican que la exposición adolescente de cannabinoides produce una desinhibición de la transmisión dopaminérgica nigroestriatal mediada por una disminución del tono gabaérgico del VP. Esta investigación muestra la susceptibilidad de la transmisión dopaminérgica adolescente a estímulos del medio y como pueden moldear los circuitos neuronales en la adultez.
Análisis y modulación de la vía de Catepsinas B y D en la fibrosis hepática en modelos in vitro e in vivo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C
(2019) Oyarzún Isamitt, Juan Esteban; Zanlungo Matsuhiro, Silvana; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) es un desorden hereditario autosómico recesivo caracterizado por la acumulación de colesterol en los lisosomas. Esta enfermedad es causada por mutaciones en los genes que codifican para las proteínas NPC1 y NPC2, las cuales están implicadas en el eflujo del colesterol desde los lisosomas. La deficiencia de NPC1 ó NPC2 lleva a una acumulación primaria de colesterol libre lisosomal y posteriormente el consecuente daño celular. Si bien no se conoce del todo los mecanismos subyacentes por los cuales el colesterol libre generaría el daño hepático en la enfermedad de NPC, se han postulado diversas opciones, entre los que destaca el estrés oxidativo, la disfunción en la dinámica de endosomas y lisosomas, así como también la disfunción en la autofagia lisosomal. El sistema nervioso central (SNC) es el más afectado en los pacientes NPC, los cuales padecen una rápida neurodegeneración progresiva a edad temprana. Otro órgano muy afectado en los pacientes NPC es el hígado, ya que muchos pacientes padecen de enfermedad hepática incluso llegando a falla hepática fulminante. Sin embargo, las causas que conllevan al daño hepático en NPC han sido poco estudiadas y dilucidadas. En los hígados de pacientes NPC se ha reportado un aumento en el contenido de colesterol libre, fibrosis progresiva y apoptosis. Recientes reportes han postulado a las catepsinas B y D como potenciales candidatos en la vía que conecta la acumulación de colesterol libre con el daño hepático, particularmente con la fibrosis hepática. Considerando todos los antecedentes previos, se formuló la siguiente hipótesis: “Las vías de las catepsinas B y D contribuyen a la fibrosis hepática en la enfermedad de NiemannPick tipo C”. El objetivo general planteado fue: “Demostrar que las vías de las catepsinas B y D contribuyen a la fibrosis en modelos hepáticos in vitro e in vivo de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C”. Los resultados de esta tesis muestran aumento en los niveles de catepsinas B y D, los que se correlacionaron con aumento en la fibrosis e inflamación en hígados de ratones NPC. Este aumento en la fibrosis también fue reproducido en los modelos hepáticos in vitro NPC. Interesantemente, la utilización de inhibidores de catepsinas B y D, CA-074 y pepstatina A, respectivamente, además de shRNA contra catepsina D, disminuyó el fenotipo pro-fibrótico en modelos celulares de hepatocitos y células estrelladas hepáticas NPC. Por otro lado, la sobreexpresión de catepsina B aumentó la fibrosis en los modelos in vitro. Los resultados obtenidos nos llevan a la conclusión que las catepsinas B y D participan en la fibrosis hepática en NPC y proponemos su inhibición como una aproximación terapéutica para tratar el daño hepático en esta enfermedad.
Attentional bias for food cues after sleeve gastrectomy : a behavioral and electrophysiological study
(2019) Zumaeta Valenzuela, Arturo Ulises; Aboitiz, Francisco; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Attentional bias for food cues (ABFC) has been linked to food craving, the inability to lose weight, and obesity. For this study, we explored the presence of ABFC in a bariatric group, using a food-modified Stroop task and visual task, with EEG and eye-tracking recording, respectively. Our data showed an increased attentional bias for appetizing food, a decreased bias for diet food and a prolonged brain processing of food stimuli in the bariatric group.
Auditory processing modulation by visual working memory load
(2021) Marcenaro Villouta, Bruno; López Hernández, Vladimir; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
La modulación descendente de las respuestas sensoriales a estímulos distractores ha sido propuesta como un importante mecanismo por el cual nuestro cerebro puede mantener información relevante en la memoria de trabajo. Trabajos anteriores en memoria de trabajo visual han reportado una modulación de las respuestas neurales a sonidos distractores en diferentes niveles de la vía auditiva central. Se desconoce si este tipo de modulación ocurre a nivel del receptor auditivo. En este trabajo se propuso como hipótesis que las respuestas cocleares a estímulos distractores pueden ser moduladas a través del sistema medial olivococlear por la memoria de trabajo visual. Veintiún sujetos (trece hombres, edad media 25.3 años) con audición normal realizaron una tarea de detección de cambio con distintas condiciones de carga de memoria de trabajo (alta carga: 4 objectos visuales; baja carga: 2 objectos visuales). Los estímulos auditivos fueron distractores y permitieron medir las emisiones otoacústicas producto de distorsión (DPOAE) y potenciales evocados de corteza. Adicionalmente, el reflejo olivococlear medial fue medido usando ruido contralateral. Los resultados mostraron mayor supresión de DPOAEs por ruido contralateral durante el periodo de memoria de trabajo. Estos resultados mostraron que durante el periodo de memoria de trabajo visual hay una modulación del reflejo olivococlear medial, lo que sugiere un posible mecanismo en común para la filtración descendente de respuestas auditivas durante procesos cognitivos.
Brain response to auditory deviance with and without conscious access
(2022) Osorio Galeano, Sergio Andrés; Aboitiz, Francisco; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
La habilidad de extraer regularidades estadísticas presentes en estímulos sensoriales y detectar cuando se presentan violaciones a dichas regularidades es de vital importancia para los organismos biológicos, en tanto median respuestas autonómicas y dirigidas a metas que son cruciales para la supervivencia. Por un lado, la extracción de regularidades estadísticas presentes en la escena sensorial permite la consolidación de un modelo interno del mundo. Por otro, la detección de violaciones en estas regularidades permite la actualización de dicho modelo, mediando así procesos de adaptación conductual. En el campo de la neurociencia cognitiva, la respuesta del cerebro a la desviación sensorial en la modalidad auditiva ha sido estudiada de manera clásica por medio de los potenciales asociados a eventos (ERPs, por su sigla en inglés). Esta literatura ha mostrado que la respuesta del cerebro a la desviación auditiva se puede caracterizar por la secuencia de dos respuestas neurales en la señal electroencefalográfica: el potencial de disparidad (MMN, por su sigla en inglés) y la respuesta P3. El MMN es un evento neural automático que puede ser observado independientemente de los estados atencionales o de consciencia de los individuos, mientras que la respuesta P3 depende crucialmente del acceso consciente a la desviación sensorial. Otros dos potenciales marcadores de la desviación auditiva son los cambios fásicos en el tamaño de la pupila e incremento evocados en el poder oscilatorio de las bandas de frecuencia theta (4-7 Hz) y beta (15-30 Hz). Mientras la literatura muestra que la detección de la desviación está acompañada de incrementos en el tamaño de la pupila (un marcador de la alerta y del sistema norepinefrinérgico) y del poder de theta y beta, no se conoce muy bien como estas respuestas neurales estarían moduladas por el acceso consciente a la desviación auditiva. Entender cómo responde el cerebro a la desviación auditiva con y sin acceso consciente nos permitiría entender la interacción dinámica existente entre mecanismos de procesamiento bottom-up y de modulación top-down durante el comportamiento enfocado a metas. En este estudio, nos propusimos entender cómo responde el cerebro a la desviación auditiva con y sin acceso consciente. Para esto, diseñamos una versión modificada de la tarea clásica de tipo oddball auditivo que nos permitió separar el procesamiento consciente del procesamiento subconsciente de la desviación auditiva. Para esto, identificamos los umbrales de discriminación consciente de cada individuo, lo cual nos permitió presentar a nuestros sujetos secuencias de tonos donde el último estímulo (el estímulo objetivo), podía ser otro tono estándar, un estímulo subumbral o un estímulo supraumbral. Los participantes debían reportar si el último estímulo de cada secuencia había sido igual o distinto de los anteriores. Por medio de esta tarea, recogimos datos conductuales (índices de sensibilidad y tiempos de reacción), pupilométricos (respuestas evocadas) y electroencefalográficos (ERPs, transformaciones de tiempo frecuencia al nivel de los electrodos y de las fuentes corticales, así como datos de conectividad funcional). Nuestros resultados muestran que las desviaciones subumbrales fueron incorrecta y sistemáticamente juzgadas como tonos estándar, lo cual refleja el procesamiento subconsciente de la desviación. En cambio, las desviaciones supraumbrales fueron correcta y sistemáticamente reportadas como diferentes, lo cual da cuenta del acceso consciente a la desviación auditiva. Además, replicamos hallazgos sobre la secuencia de MMN y P3 como marcadores confiables del procesamiento consciente y subconsciente de la desviación. Los datos pupilométricos sugieren que todos los estímulos objetivos están asociados a una respuesta pupilar, pero que dicha respuesta es mayor durante el procesamiento subconsciente de la desviación auditiva, reflejando de esta manera el procesamiento de la incertidumbre perceptual inesperada. Incrementos en el poder de theta y beta fueron observados en regiones corticales previamente asociadas con los orígenes del MMN y P3, incluyendo regiones temporales, prefrontales y cinguladas. Mientras que el poder de theta en regiones temporales reflejaría predicciones auditivas y mantención de la información sobre la identidad de un estímulo auditivo novedoso, los incrementos en el poder de beta en regiones prefrontales y cinguladas reflejarían la detección de un error en la predicción y la incertidumbre sensorial. Finalmente, incrementos en la conectividad funcional dentro del rango de theta reflejarían intercambio de información entre procesadores corticales distribuidos globalmente, lo cual soportaría la percepción consciente y la toma de decisiones, mientras que incrementos de conectividad funcional dentro del rango de beta reflejarían procesos de modulación top-down señalando así la necesidad de adaptación de los niveles de alerta debido a una alta incertidumbre y mecanismos de detección de errores en la predicción que son sensibles a una mayor saliencia del evento sensorial. Nuestros resultados subrayan como el cerebro asigna pesos a los mecanismos bottom-up y top-down durante el comportamiento enfocado a metas en función de si los eventos sensoriales son percibidos conscientemente o no, así como la contribución de la adaptación de la alerta durante esta interacción entre mecanismos de procesamiento de la información sensorial. Eso ilustra además la relación dinámica y en constante adaptación entre percepción y cognición.
C-ABL kinase in Niemann Pick type a disease : its implication in the pathogenic mechanisms leading to autophagic flux alterations and neurodegeneration.
(2020) Marín Marín, Tamara Alejandra; Zanlungo Matsuhiro, Silvana; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Niemann-Pick type A (NPA) disease is a fatal lysosomal neurodegenerative and autosomal recessive disorder. It is characterized by deficiency in acid sphingomyelinase (ASM) and accumulation of sphingomyelin and cholesterol in lysosomes. Unfortunately, there is no cure for patients who die between 2-3 years of age. Previously we described that the c-Abl proapoptotic signaling pathway is key in neuronal death in different neurodegenerative diseases, including lysosomal disorders. Furthermore, recent studies show a role for c-Abl in autophagy and cellular clearance, processes that depend on the lysosome, and are essential for keeping cellular homeostasis. Indeed, autophagy dysfunctions are involved in different pathologies, including neurodegenerative diseases. Considering these antecedents, we propose to evaluate if c-Abl is hyperactivated and modulates autophagy and cellular clearance in NPA disease. The hypothesis of this thesis is that c-Abl hyperactivation blocks the autophagy flux contributing to the neuronal pathogenesis in Niemann Pick type A disease. Our general aim is to determine if c-Abl hyperactivation blocks the autophagy flux contributing to the neuronal pathogenesis in Niemann Pick type A disease. The specific aims are: 1) To determine if the c-Abl signaling pathway is hyperactivated and participates in NPA disease neurodegeneration and 2) To evaluate if hyperactivation of the c-Abl signaling pathway inhibits autophagy flux in NPA models. We used several NPA models including; fibroblasts from NPA patients, Neural Stem Cells derived from these fibroblasts and a NPA mouse. In these models we modulated c-Abl activity and evaluated cell death, cerebellar inflammation and autophagy flux. Our results show that: i) c-Abl is hyperactivated and contributes to the neurodegeneration in in vitro and in vivo NPA models; ii) There are lysosomal and autophagy alterations in NPA models; iii) c-Abl inhibition induces autophagy and decreases lipid accumulation in in vitro NPA models; iv) c-Abl inhibition decreases neuronal death and inflammation at the cerebellum and improves locomotor function in NPA mice and v) the downregulated genes in NPA fibroblasts increase their expression upon Imatinib treatment. Interestingly, these genes are direct or indirectly related with autophagy. These results give new antecedents to understand the role of c-Abl in autophagy regulation and its contribution to the NPA disease pathogenic mechanisms. Additionally, these results allow us to propose c-Abl inhibitors as a therapeutic option for this disease.
Caracterización de las funciones del factor de transcripción FOXO1 asociadas a la remodelación del tejido conectivo gingival: implicancias en el envejecimiento
(2021) Rojas Cortéz, Leticia Andrea; Smith Ferrer, Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Introducción/Objetivo: La reparación de heridas está dirigida por múltiples factores de transcripción. Durante la reparación de heridas se activa el factor de transcripción Forkhead Box O 1 (FOXO1). El aumento del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) activa la función transcripcional de FOXO1 en fibroblastos. En este estudio se evaluó las funciones asociadas a reparación tisular reguladas por FOXO1 y el impacto que ejerce el envejecimiento sobre esta regulación. Material y método: Se utilizaron dos modelos de pérdida de función de FOXO1 con el fin de determinar la regulación de genes y funciones asociadas a reparación de herida. Los fibroblastos gingivales humanos fueron tratados con el inhibidor químico de FOXO1: AS1842856. Mientras que en el modelo in vivo se utilizó un ratón FOXO1 knock-out fibroblasto específico. Se evaluó la regulación mediada por FOXO1 sobre los transcritos y proteínas de la actina de músculo liso tipo alfa (α-SMA), fibronectina y la organización integrina beta 1 (β1) activa. Además, se llevaron a cabo ensayos funcionales de spreading, contracción de colágeno y cierre de herida in vitro. Por otra parte, se generó un atlas transcriptómico a partir de heridas de mucosa oral en ratones jóvenes y envejecidos del genotipo Col1a2-Cre.FOXO1. Se comparó la distribución de poblaciones y genes altamente expresados entre los clústeres mesenquimales. Adicionalmente, se evaluó el depósito de nuevo colágeno en muestras histológicas. Los resultados in vitro se presentaron como promedio ± SD. Se utilizaron las pruebas de ANOVA o Kruskal-Wallis seguidas de post-hoc de Tukey o Dunn para los ensayos in vitro. Los datos de transcriptómica se presentaron como la mediana y se analizaron mediante la prueba Wilcoxon rank sum con corrección de Bonferroni. Se consideró significancia estadística un valor de p<0.05. Resultados: La inhibición de FOXO1 redujo la diferenciación a miofibroblastos, los niveles de fibronectina, colágeno tipo I e integrina-β1 en fibroblastos gingivales humanos tratados con TGFβ1. Además, se observó que la inhibición de FOXO1 reduce significativamente el spreading celular, la contracción de colágeno y el cierre de herida in vitro. La deleción de FOXO1 en ratones jóvenes retrasó la reparación debido, en parte, a un menor depósito de colágeno y la reducción de células mesenquimales. Por otra parte, el efecto del envejecimiento se manifestó en una disminución de las poblaciones mesenquimales más abundantes y una reducción de colágeno fibrilar. Sin embargo, la deleción de FOXO1 en ratones envejecidos no alteró el depósito de nuevo colágeno. Los datos de transcriptómica muestran que FOXO1 regula la expresión de múltiples tipos de colágeno en ratones jóvenes y envejecidos. Cabe destacar que la deleción de FOXO1 en ratones envejecidos favorece el aumento de metaloproteinasas. Conclusiones: FOXO1 cumple un rol crítico en la regulación de múltiples funciones celulares asociadas a reparación inducidas por TGF-β1 en fibroblastos gingivales. Por primera vez, se sugiere que FOXO1 controla la formación de clústeres de integrina-β1. Además, se presenta el primer atlas transcriptómico de heridas orales. FOXO1 regula transcripcionalmente a múltiples tipos de colágenos y se sugiere que FOXO1 pierde parcialmente su capacidad regulatoria sobre colágeno fibrilar en ratones envejecidos.
Caracterización y efectos de las LDL y HDL de mujeres con hipercolesterolemia durante el embarazo sobre la función vascular materna y de células endoteliales
(2022) Cantín González, Claudette Alejandra; Leiva Mendoza, Andrea Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
La hipercolesterolemia es uno de los principales factores de riesgo asociados a ateroesclerosis. Durante el embarazo ocurre un aumento fisiológico (MPH) o suprafisiológico (MSPH) de los niveles de colesterol maternos, siendo limitada la evidencia respecto a los efectos adversos de esta condición en la vasculatura materna. Además, el embarazo se asocia con cambios en el metabolismo de las LDL y HDL maternas, lipoproteínas cuya composición y función son fundamentales para la salud vascular materna, al ser capaces de modular diversas funciones en las células endoteliales. Así, la presente tesis propone estudiar si MSPH se asocia con disfunción vascular materna al tercer trimestre del embarazo, así como también con cambios en la composición y función de las lipoproteínas maternas, las que podrían mediar efectos pro-aterogénicos sobre células células endoteliales. Para comprobar esta hipótesis, nuestro estudio contempló 34 embarazadas MPH y 23 MSPH, clasificadas según sus niveles de colesterol al término del embarazo. Los resultados obtenidos en suero sugieren que las mujeres MSPH se caracterizarían por un perfil pro-aterogénico al estar expuestas a mayor peroxidación lipídica, presentando también mayores marcadores de disfunción vascular comparado con MPH. Al purificar las lipoproteínas maternas, las LDL de mujeres MSPH presentaron cambios en su composición proteica y lipídica, así como también en su función, siendo más susceptibles a oxidación y disminuyendo la biodisponibilidad endotelial de óxido nítrico. Las HDL MSPH presentaron cambios en la abundancia proteica y actividad de la enzima antioxidante PON1, además de una mayor capacidad antioxidante y menor capacidad de inducir la producción de óxido nítrico en células endoteliales, comparado con MPH. En conclusión, la condición MSPH se relaciona con disfunción vascular materna al tercer trimestre del embarazo, así como también con cambios en la composición y función de las lipoproteínas maternas.
Children's sociemotional development at 12 and 30 months and its relationship with mother's mentalization : comparison of chilean and U.S. mothers
(2018) Espinoza Díaz, Nancy Alejandra; Farkas K., Chamarrita; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Psicología; Universidad de Chile. Facultad de Medicina
Socio-emotional development refers to the ability of infants to regulate their emotions and behavior in order to adapt to the world in which they live. It is a complex process that requires the conjugation of biological mechanisms of the infant him/herself, and the context where development unfolds. In order to achieve an adequate socio-emotional development, the quality of the primary bond relationships is fundamental. However, a competence that has not been studied is the capacity of mothers to perceive their children, at 12 months, as individuals with minds, through the mentalizing language that they use in the interaction, and the impact they have on their children's socio-emotional development at 12 and 30 months, in different contexts. The objective of this research was to describe the relationship between the socioemotional development of infants at 12 and 30 months of age and the mentalization capacity of mothers in Chilean and US dyads. In order to achieve the proposed objective, a quantitative methodology, with a non-experimental and longitudinal design, was used. The sample consisted of 142 mother-child dyads, 90 Chilean and 52 US. The instruments used were the assessment standard of Mentalization in the adult and The Bayley Scales of Infant and Toddler Development, Third Edition. The results showed that there are significant differences in the increment of socio-emotional child development according to country; however, the maternal educational level mediates these differences. Significant differences were observed between the type of mentalizing language used by Chilean and US mothers, that is, the study suggests the existence of specificity related to the context. Finally, the relationship between mentalizing language and socio-emotional development is confirmed, finding that talking about emotions at 12 months is significantly associated with socioemotional development at 30 months.
Contribución de la provisión materna de vitamina E a la regulación del balance rédox y la prevención del daño oxidativo durante el cierre del tubo neural en ratón
(2022) Quiroz Vallverdú, Alonso Ingmar; Busso, Dolores; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Los defectos en el cierre del tubo neural (NTD) corresponden a un grupo de malformaciones congénitas del tubo neural, estructura formada durante el desarrollo embrionario temprano que da origen al cerebro y la médula espinal. Entre los factores no genéticos involucrados en la etiología del NTD se encuentran alteraciones metabólicas de la madre y el consumo inadecuado de algunos micronutrientes, como el folato o vitamina B9. En humanos, la obesidad materna y la diabetes han sido reconocidas como factores de riesgo de NTD y se ha propuesto que el estrés oxidativo asociado a estas condiciones interfiere con el cierre del tubo neural. En los últimos años, nuestro laboratorio reportó que cerca del 30-50% de los embriones deficientes para la proteína Scavenger Receptor Class B Type I (SR-B1 KO), el principal receptor de lipoproteínas de alta densidad (HDL), presentan NTD anterior que progresa a anencefalia. Durante el desarrollo temprano, SR-B1 es expresado en tejidos extraembrionarios, específicamente en los trofoblastos gigantes que componen el saco vitelino parietal (pYS). Los embriones SRB1 KO presentan mayores niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS) y contienen menos vitamina E que los embriones SR-B1 silvestres o wild type (WT), sugiriendo que SR-B1 participa en la provisión materna de la vitamina E al embrión. La suplementación materna con α-tocoferol, principal isómero de la vitamina E, previene completamente la incidencia de NTD y normaliza los niveles de ROS en los embriones SR-B1 KO, sugiriendo que el daño oxidativo pudiera contribuir a la etiología de los NTD en este modelo. El α-tocoferol es un antioxidante liposoluble que, coordinadamente con el sistema antioxidante endógeno, detiene la reacción en cadena de la peroxidación lipídica, protegiendo a los lípidos del daño oxidativo. En especial, esta vitamina preservaría los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), lípidos esenciales para el desarrollo embrionario. En la primera parte de esta tesis, evaluamos el status oxidativo en embriones WT, SR-B1 KO normales y SR-B1 KO con NTD mediante la determinación de los niveles de algunas moléculas antioxidantes endógenas y de un marcador de lipoperoxidación. Adicionalmente, caracterizamos las abundancias relativas de PUFAs en fosfolípidos y otros lípidos en los respectivos grupos embrionarios usando la tecnología de shotgun lipidomics. Los resultados obtenidos no mostraron una alteración del sistema antioxidante endogéno en los embriones SR-B1 KO, pero sí un aumento de la lipoperoxidación. Ni los niveles de vitamina E embrionaria ni la peroxidación lipídica se previnieron al suplementar a las madres con una dieta enriquecida con vitamina E. En conjunto, estos resultados sugieren que el mecanismo de acción de la vitamina E en la prevención de los NTD en embriones SR-B1 KO estaría mediado por un efecto no sobre el embrión mismo, sino indirecto y mediado por el pYS. Sin embargo, el análisis mediante WB de vías de señalización asociadas a la producción de ROS extracelular en el pYS no mostró diferencias entre tejidos de preñeces con o sin la intervención con vitamina E. Si bien el rol de dicho tejido embrionario en la prevención de NTD mediada por vitamina E no pudo ser demostrado, es posible que otras vías o procesos indirectos, no analizados en esta tesis, expliquen dicho efecto. A través del análisis de lipidómica observamos que la deficiencia de SR-B1 se asoció a niveles disminuidos de PUFAs de cadena larga (LCPUFAs), así como de ácidos grasos monoinsaturados (MUFAs) en determinados fosfolípidos y niveles aumentados de lisofosfatidilcolina (LPC), lo cual sugiere la hidrólisis aumentada de lípidos de membrana. Un resultado inesperado de este estudio fue que los embriones SR-B1 KO con NTD exhibieron acumulación de triglicéridos (TG), lo que indicaría movilización de ácidos grasos desde la membrana a gotas lipídicas. Este mecanismo adaptativo se ha observado previamente en células gliales y cancerígenas para proteger a los lípidos de la oxidación y/o la inflamación. Teniendo en cuenta que la obesidad generalmente cursa con un mayor estado oxidativo en humanos y animales, en la segunda parte de esta tesis hipotetizamos que el consumo de una dieta rica en grasas y azúcares (“high fat/high sugar”, HFHS) en ratonas SR-B1 heterocigotas reduciría la provisión embrionaria de vitamina E y aumentaría la incidencia de NTD debido a un aumento en los requerimientos antioxidantes maternos. Tal como esperábamos, la dieta HFHS indujo una alteración en el metabolismo materno de la glucosa y los lípidos, y aumentó la incidencia de NTD en los embriones KO y heterocigotos, y también se asoció a la ocurrencia de NTD en embriones WT. Además, la alimentación de las ratonas con esta dieta provocó retardo del desarrollo de los embriones, de manera independiente del genotipo de SR-B1. Los efectos teratogénicos de la dieta no fueron mediados por una reducción en los niveles de la vitamina E en plasma materno ni tampoco observamos un aumento en el daño oxidativo en madres o embriones de gestaciones del grupo HFHS. Interesantemente, mientras que las hembras alimentadas con la dieta HFHS presentaron intolerancia a la glucosa, mayores niveles de péptido C plasmático, hipercolesterolemia y acumulación de colesterol en hígado y pYS, la suplementación con vitamina E en ratonas del grupo HFHS previno la incidencia de NTD y el retardo del desarrollo, y corrigió todas las anormalidades metabólicas maternas mencionadas. Estos resultados sugieren que la vitamina E podría ejercer un efecto protector sobre el metabolismo materno, con potenciales ventajas sobre el embrión. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la vitamina podría prevenir los NTD a través de los siguientes mecanismos: I) manteniendo los niveles adecuados de PUFAs en fosfolípidos en el embrión en desarrollo, posiblemente mediante mecanismos no-antioxidantes, y II) en hembras consumiendo una dieta obesogénica, previniendo las perturbaciones metabólicas maternas en glúcidos y lípidos. Estos resultados confirman que la vitamina E y los PUFAs son moléculas relevantes para el cierre del tubo neural. Por lo tanto, la adecuación de la ingesta de estos lípidos podría servir como estrategia para prevenir los NTD, especialmente en condiciones como la obesidad, diabetes o dislipidemias.
Cornifelin expression during Xenopus laevis metamorphosis and in response to spinal cord injury
(2022) Torruella González, Sol; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Xenopus laevis tiene la capacidad de regenerar luego de un daño en sus estadios larvales (NF50), pero al término de la metamorfosis pierde esta capacidad (NF-66). En una secuenciación de ARN de alto rendimiento, se analizaron los transcritos de animales NF-50 y NF-66, 21 horas, 2 y 6 días luego del daño a la médula espinal por transección. Cornifelina fue uno de los transcritos más altamente expresados dos días después del daño en NF-66, lo que sugiere un rol luego del daño a la médula espinal. La expresión de cornifelina ha sido detectada previamente principalmente en epitelios escamosos estratificados como piel y mucosas, pero su expresión en estructuras del sistema nervioso central no ha sido descrita. Aquí, usando técnicas histológicas, moleculares y bioquímicas, reportamos la expresión de cornifelina en la médula espinal, en la retina y en la córnea de Xenopus laevis durante la metamorfosis; evaluamos la reacción meníngea luego del daño por transección de la médula espinal y caracterizamos una línea transgénica para cornifelina. La expresión de cornifelina fue detectada en la sustancia gris y meninges de la médula espinal de animales NF-50 y NF-66. La expresión en la sustancia gris disminuyó a lo largo de la metamorfosis. En retina, cornifelina fue detectada en la capa de células ganglionares, en las capas nucleares internas y externas y en el segmento externo en NF-50 y NF-66. Luego del daño a la médula espinal, la expresión de cornifelina fue regulada a la alta en animales NF-66. Además, encontramos que la expresión en meninges fue distinta luego del daño en NF-50 y NF66. En NF-50, células positivas para cornifelina fueron encontradas cerrando el sitio de daño un día luego de la transección. En los siguientes días, fue encontrada delineando el tejido nervioso en reconexión. Por otro lado, en NF-66, células positivas para cornifelina fueron encontradas en las meninges y en la porción ventral de la médula a los seis días luego del daño y en el sitio de daño a los diez días. Estos resultados sugieren que cornifelina participaría en la reacción meníngea luego del daño por transección a la médula espinal.
Cross cerebro-cerebellar language lateralization in lesioned and unlesioned brains: a functional and structural neuroimaging study
(2022) Thakkar, Ishani Rajendra; Mendez Orellana, Carolina; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Una de las habilidades cognitivas más avanzadas que distingue a los humanos de otras especies es el lenguaje: la capacidad de tener un sistema complejo de sonidos asociados con distintos significados para expresar pensamientos y emociones. Los estudios de neuroimagen en sujetos sanos y con lesiones han demostrado que las funciones del lenguaje dependen de la integración funcional de varias regiones especializadas en los lóbulos temporal y frontal, es decir, las áreas de Wernicke y Broca respectivamente (Purves et al., 2004). Estas regiones están ubicadas en el hemisferio cerebral izquierdo en el lóbulo temporal y en el lóbulo frontal, respectivamente, para alrededor del 95% de las personas diestras y alrededor del 70% de las personas zurdas (Griggs, 2010). Como es evidente, las funciones del lenguaje están desigualmente representadas en los dos hemisferios cerebrales, es decir, están lateralizadas. Especialmente en personas diestras, las funciones específicas del lenguaje, como la comprensión, el vocabulario y la gramática, suelen estar lateralizadas hacia el hemisferio izquierdo (Taylor & Taylor, 1990). La producción del habla también está lateralizada a la izquierda en la mayoría de las personas diestras, mientras que puede ser atípica, es decir, bilateral o lateralizada a la derecha, en una fracción de la población zurda (Beaumont, 2008). Curiosamente, la localización y lateralización del lenguaje no se limitan a las regiones corticales, es decir, supratentoriales. Se ha demostrado que el cerebelo (que es parte del cerebro infratentorial) contralateral al hemisferio 'dominante del lenguaje' participa en la regulación del lenguaje en términos de fluidez verbal, gramática, corrección de errores del lenguaje y habilidades de escritura (Starowicz-Filip et al., 2017). Las deficiencias en el procesamiento del lenguaje afectan de manera aguda la calidad de vida, por lo que el personal clínico hace todo lo posible para identificar y preservar las áreas corticales involucradas en su comprensión y producción. En consecuencia, comprender la lateralización del lenguaje se vuelve especialmente importante en los procedimientos neuroquirúrgicos, donde existe la necesidad de mapear las funciones del lenguaje en los pacientes con el fin de preservar regiones elocuentes del cerebro. Esto es particularmente relevante en procedimientos que implican la extirpación quirúrgica de tumores cerebrales. Si bien ha habido evidencia de lateralización cruzada del lenguaje cerebro-cerebeloso relacionada con el dominio del lenguaje en pacientes con tumores cerebrales (Hubrich-Ungureanu et al., 2002), los estudios clínicos de neuroimagen que evalúan la lateralización del lenguaje hemisférico se enfocan principalmente solo en el cerebro supratentorial. Sin embargo, un estudio reciente proporcionó evidencia de que estas activaciones pueden actuar como una característica adicional para evaluar el dominio del lenguaje con lateralización del lenguaje tanto típica como atípica (Méndez Orellana et al., 2015). Este estudio abrió vías para probar si la activación del lenguaje en el cerebelo puede guiar la determinación del dominio del lenguaje porque la activación del cerebelo generalmente no se ve afectada por el tumor localizado en las presuntas áreas corticales del lenguaje. Además, estas activaciones cruzadas son de especial interés en la recuperación y rehabilitación del lenguaje en pacientes con afasia, ya que pueden ayudar a visualizar la reorganización del lenguaje y revelar una lateralización atípica del lenguaje que, a su vez, puede ayudar a definir la viabilidad de lobectomías salvadoras en estos pacientes (Méndez Orellana et al., 2012). Esto puede resultar especialmente útil en los casos en que el tumor dificulte la determinación de la lateralización. Hasta ahora, solo se han utilizado paradigmas de generación de verbos encubiertos para estudiar estas activaciones (FitzGerald et al., 1997; Hubrich Ungureanu et al., 2002). Estas tareas son difíciles de monitorear en el escáner y pueden ser un desafío para los pacientes, especialmente si su tumor afecta las regiones del lenguaje. Por lo tanto, además del paradigma tradicional de generación de verbos, utilizamos tareas de asociación semántica y fonológica como paradigmas lingüísticos alternativos y más fáciles para establecer la ocurrencia de las activaciones cruzadas en sujetos que tenían dificultad para realizar las primeras. Estas activaciones podrían observarse no solo en sujetos sanos, sino también en pacientes con tumores cerebrales en las tres tareas a pesar de que la lesión cerebral afecta la señal dependiente del nivel de oxígeno en sangre (BOLD) (Thakkar et al., 2022). Esto fue cierto para una cohorte con pacientes diestros y zurdos con un tumor cerebral, así como controles sanos diestros y zurdos incluidos de los compañeros de los pacientes y emparejados por edad, sexo y nivel educativo. Una vez establecida la presencia de estas activaciones en los pacientes, evaluamos y comparamos diferentes índices utilizados para la determinación de lateralización (LI) basados en activaciones BOLD tanto en la corteza como en el cerebelo. Si bien el método actual utilizado en la clínica es bastante sólido, existen ciertos desafíos para implementarlo. Se demostró que los cálculos de LI en fMRI dependen del umbral de confianza estadística que se utiliza para determinar el número de vóxeles activados (Ruff et al., 2008). Por lo tanto, usamos una técnica de cálculo de LI independiente del umbral (Branco, et al., 2006; Suarez et al., 2009) y los comparamos con experiencia manual para verificar su confiabilidad en la clínica, ya que estos métodos aún se están explorando en entornos experimentales. y requieren más confirmaciones clínicas. Como una validación adicional de la activación funcional cruzada que parece estar ocurriendo entre la corteza dominante del lenguaje y el cerebelo mientras se realizan tareas de lenguaje, también estudiamos la conexión anatómica de la materia blanca entre estas dos estructuras que reclutan específicamente al cerebelo para contribuir a las funciones de procesamiento verbal tanto en sujetos sanos como en sujetos con tumor cerebral. Para comprender mejor la lateralización del lenguaje en estas cohortes, establecimos la presencia de estos tractos de materia blanca relacionados con el lenguaje. En pocas palabras, esta tesis utiliza datos funcionales, así como datos de tractografía recopilados de sujetos sanos y pacientes con tumores cerebrales para investigar los mecanismos anatómicos y funcionales de las activaciones cerebro-cerebelosas cruzadas típicas y atípicas. Descubrimos que las tareas de asociación semántica y fonológica eran consistentes con la tarea de generación de verbos y, por lo tanto, pueden resultar herramientas útiles en la determinación de la materalización del lenguaje cerebro-cerebeloso cruzado prequirúrgico. También observamos que las técnicas de LI independientes de umbral no son consistentemente congruentes con la lateralización asignada manualmente. Además, se observó que una buena parte de nuestras dos cohortes demostraron tractos de materia blanca que conectan el cerebelo contralateral con las principales regiones del lenguaje individualmente. Los hallazgos de este proyecto arrojan luz sobre sus mecanismos en los cerebros lesionados, así como sobre la importancia del cerebelo en la identificación de la lateralización típica y atípica del lenguaje en pacientes con tumores cerebrales o no.
Desbalance en los niveles de colesterol y esfingolípidos y su efecto en la pérdida de caveolas, señalización insulínica y diferenciación en adipocitos Agpat2-/-.
(2020) González Hódar, Lila Alejandra; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
El tejido adiposo es un regulador del balance energético y de la homeostasis glucídica y lipídica en mamíferos. La lipodistrofia congénita generalizada (LCG) es un síndrome caracterizado por reducción severa de la masa de tejido adiposo corporal total y complicaciones metabólicas. Mutaciones en el gen AGPAT2 son la causa más frecuente de LCG. AGPAT2 codifica para la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa 2, que cataliza la síntesis de ácido fosfatídico a partir de ácido lisofosfatídico en la vía de síntesis de los glicerolípidos. Los mecanismos que determinan la LCG dependiente de mutaciones en AGPAT2 no están dilucidados. Los ratones deficientes en AGPAT2 (Agpat2-/- ) nacen con tejido adiposo blanco y pardo, pero este degenera durante la primera semana de vida postnatal, como resultado de muerte selectiva de adipocitos e infiltración inflamatoria del tejido adiposo. Por otro lado, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y preadipocitos aislados a partir del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- presentan adipogénesis deteriorada in vitro, caracterizada por menor abundancia de gotas lipídicas y menor expresión génica de reguladores de la adipogénesis. El análisis ultraestructural de adipocitos del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- y MEFs Agpat2-/- diferenciados adipogénicamente in vitro mostró una cantidad significativamente disminuida de caveolas. Las caveolas son microdominios de la membrana plasmática de 50 a 100 nm de diámetro, muy abundantes en adipocitos y células endoteliales. Están involucradas en funciones importantes del adipocito: unión, transporte intracelular y almacenamiento de ácidos grasos y colesterol, activación de vías de señalización adipogénicas y protección contra los efectos lipotóxicos de niveles elevados de ácidos grasos. La formación de caveolas requiere la presencia de las proteínas caveolina-1 y cavina-1, y una adecuada composición lipídica de la membrana plasmática (MP), caracterizada por enriquecimiento de colesterol y esfingolípidos. El objetivo general de esta tesis fue determinar el mecanismo por el cual adipocitos Agpat2- /- presentan un bajo número de caveolas y el rol potencial de las caveolas en la patogenia de la lipodistrofia en ratones Agpat2-/- . Para esto, combinamos experimentación in vitro usando un modelo de diferenciación adipogénica a partir de preadipocitos obtenidos de la fracción estromalvascular del tejido adiposo pardo interescapular de estos animales, e in vivo, analizando el tejido adiposo de ratones Agpat2-/- durante sus primeros días de vida postnatal, en etapas anteriores a su degeneración inflamatoria. Primero, confirmamos que tanto el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2- /- como adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro presentan un bajo número de caveolas en comparación con animales y adipocitos en cultivo Agpat2+/+ (wild type). Sin embargo, y contrario a lo esperado, la vía de insulina, que ha sido reportada como dependiente de caveolas, se encuentra preservada en adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro, y su nivel de activación no se modifica a lo largo de todos los días de diferenciación evaluados. No encontramos diferencias en la abundancia de proteínas caveolina-1 y cavina-1 pero sí en su localización subcelular a día 5 y 10 de diferenciación. Así, mientras en adipocitos wild type ambas proteínas presentan localización en la periferia de las células, compatible con una destinación en la MP, en adipocitos Agpat2-/- presentan una localización intracelular, con formación de agregados o acúmulos de tamaño heterogéneo. El análisis de composición lipídica celular total mostró que en el día 0 de diferenciación adipogénica no hay diferencias en los niveles de las diferentes especies de lípidos evaluados entre preadipocitos de ambos genotipos. Por el contrario, en el día 10 de diferenciación, los adipocitos Agpat2-/- presentaron agregaciones o acúmulos de colesterol intracelular, junto con mayores niveles de 7-dehidrodesmoterol y esfingomielina, y menores niveles de fosfatidiletanolamina y lisofosfatidiletanolamina. Los acúmulos de colesterol intracelular también fueron detectados en el tejido adiposo blanco subcutáneo (día postnatal P0.5 y P2.5) y en el tejido adiposo pardo interescapular (día postnatal P4.5) de ratones Agpat2-/- pero no wild type. Además, el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2-/- posee mayor abundancia de ceramidas en combinación con menores niveles de los fosfolípidos fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina en el día postnatal P4.5. Para evaluar posibles mecanismos involucrados en los desbalances lipídicos de los adipocitos Agpat2-/- , cuantificamos los niveles de mRNA de algunos genes clave del metabolismo de colesterol y esfingolípidos en tres tiempos de diferenciación adipogénica in vitro. No observamos diferencias entre genotipos en el perfil de expresión génica en los días 0 y 5 de diferenciación, sin embargo, en el día 10, los adipocitos Agpat2-/- presentan niveles aumentados tanto de los genes Abca1, Ldlr, Lrp, Srbi, Srebp2 y Hmg-CoAR, implicados en la homeostasis del colesterol así como de Sptlc2, Asah1, GlcT y Smpd1, los que están involucrados en la síntesis de esfingolípidos. Para estudiar de forma directa la participación de lípidos de la MP en la deficiencia de caveolas en lo adipocitos deficientes en AGPAT2, determinamos la composición lipídica de preparaciones purificadas de MP de adipocitos diferenciados adipogénicamente in vitro y del tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. No encontramos diferencias en los niveles de colesterol, esteroles y esfingolípidos entre células Agpat2-/- y wild type en el día 0 de diferenciación (cuando las células corresponden a preadipocitos), pero sí mayores niveles de fosfatidilglicerol en preadipocitos Agpat2-/- . En el día 10 de diferenciación, la MP de los adipocitos Agpat2-/- presentó mayor abundancia de fosfatidilserina y 8(9)-dehidrocolesterol. En la MP del tejido adiposo pardo interescapular de ratones recién nacidos, no encontramos diferencias en los niveles de colesterol entre genotipos, pero sí mayores niveles de zimosterol y FFMAS en ratones Agpat2-/- . Por lo tanto, con nuestros resultados podemos concluir que el número reducido de caveolas en adipocitos Agpat2-/- se asocia a niveles elevados de fosfatidilglicerol en el estado de preadipocito (día 0 post inducción adipogénica) y niveles elevados de fosfatidilserina en el estado de adipocito (día 10 post inducción adipogénica). Además, es posible que alteraciones en la distribución celular de caveolina-1 y cavina-1 contribuyan al déficit en el número de caveolas. Estas alteraciones podrían conducir a un tráfico anormal de colesterol, que determina la presencia de acúmulos intracelulares de este lípido y mayor actividad biosintética de colesterol, producto de su retención en compartimentos que previenen su destinación normal a la membrana del RE. Por otro lado, la deficiencia de caveolas podría promover o facilitar la muerte celular lipotóxica de los adipocitos Agpat2-/- , producto de su mayor sensibilidad a ácidos grasos y también por la acumulación excesiva de depósitos intracelulares de colesterol.El tejido adiposo es un regulador del balance energético y de la homeostasis glucídica y lipídica en mamíferos. La lipodistrofia congénita generalizada (LCG) es un síndrome caracterizado por reducción severa de la masa de tejido adiposo corporal total y complicaciones metabólicas. Mutaciones en el gen AGPAT2 son la causa más frecuente de LCG. AGPAT2 codifica para la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa 2, que cataliza la síntesis de ácido fosfatídico a partir de ácido lisofosfatídico en la vía de síntesis de los glicerolípidos. Los mecanismos que determinan la LCG dependiente de mutaciones en AGPAT2 no están dilucidados. Los ratones deficientes en AGPAT2 (Agpat2-/- ) nacen con tejido adiposo blanco y pardo, pero este degenera durante la primera semana de vida postnatal, como resultado de muerte selectiva de adipocitos e infiltración inflamatoria del tejido adiposo. Por otro lado, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y preadipocitos aislados a partir del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- presentan adipogénesis deteriorada in vitro, caracterizada por menor abundancia de gotas lipídicas y menor expresión génica de reguladores de la adipogénesis. El análisis ultraestructural de adipocitos del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- y MEFs Agpat2-/- diferenciados adipogénicamente in vitro mostró una cantidad significativamente disminuida de caveolas. Las caveolas son microdominios de la membrana plasmática de 50 a 100 nm de diámetro, muy abundantes en adipocitos y células endoteliales. Están involucradas en funciones importantes del adipocito: unión, transporte intracelular y almacenamiento de ácidos grasos y colesterol, activación de vías de señalización adipogénicas y protección contra los efectos lipotóxicos de niveles elevados de ácidos grasos. La formación de caveolas requiere la presencia de las proteínas caveolina-1 y cavina-1, y una adecuada composición lipídica de la membrana plasmática (MP), caracterizada por enriquecimiento de colesterol y esfingolípidos. El objetivo general de esta tesis fue determinar el mecanismo por el cual adipocitos Agpat2- /- presentan un bajo número de caveolas y el rol potencial de las caveolas en la patogenia de la lipodistrofia en ratones Agpat2-/- . Para esto, combinamos experimentación in vitro usando un modelo de diferenciación adipogénica a partir de preadipocitos obtenidos de la fracción estromalvascular del tejido adiposo pardo interescapular de estos animales, e in vivo, analizando el tejido adiposo de ratones Agpat2-/- durante sus primeros días de vida postnatal, en etapas anteriores a su degeneración inflamatoria. Primero, confirmamos que tanto el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2- /- como adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro presentan un bajo número de caveolas en comparación con animales y adipocitos en cultivo Agpat2+/+ (wild type). Sin embargo, y contrario a lo esperado, la vía de insulina, que ha sido reportada como dependiente de caveolas, se encuentra preservada en adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro, y su nivel de activación no se modifica a lo largo de todos los días de diferenciación evaluados. No encontramos diferencias en la abundancia de proteínas caveolina-1 y cavina-1 pero sí en su localización subcelular a día 5 y 10 de diferenciación. Así, mientras en adipocitos wild type ambas proteínas presentan localización en la periferia de las células, compatible con una destinación en la MP, en adipocitos Agpat2-/- presentan una localización intracelular, con formación de agregados o acúmulos de tamaño heterogéneo. El análisis de composición lipídica celular total mostró que en el día 0 de diferenciación adipogénica no hay diferencias en los niveles de las diferentes especies de lípidos evaluados entre preadipocitos de ambos genotipos. Por el contrario, en el día 10 de diferenciación, los adipocitos Agpat2-/- presentaron agregaciones o acúmulos de colesterol intracelular, junto con mayores niveles de 7-dehidrodesmoterol y esfingomielina, y menores niveles de fosfatidiletanolamina y lisofosfatidiletanolamina. Los acúmulos de colesterol intracelular también fueron detectados en el tejido adiposo blanco subcutáneo (día postnatal P0.5 y P2.5) y en el tejido adiposo pardo interescapular (día postnatal P4.5) de ratones Agpat2-/- pero no wild type. Además, el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2-/- posee mayor abundancia de ceramidas en combinación con menores niveles de los fosfolípidos fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina en el día postnatal P4.5. Para evaluar posibles mecanismos involucrados en los desbalances lipídicos de los adipocitos Agpat2-/- , cuantificamos los niveles de mRNA de algunos genes clave del metabolismo de colesterol y esfingolípidos en tres tiempos de diferenciación adipogénica in vitro. No observamos diferencias entre genotipos en el perfil de expresión génica en los días 0 y 5 de diferenciación, sin embargo, en el día 10, los adipocitos Agpat2-/- presentan niveles aumentados tanto de los genes Abca1, Ldlr, Lrp, Srbi, Srebp2 y Hmg-CoAR, implicados en la homeostasis del colesterol así como de Sptlc2, Asah1, GlcT y Smpd1, los que están involucrados en la síntesis de esfingolípidos. Para estudiar de forma directa la participación de lípidos de la MP en la deficiencia de caveolas en lo adipocitos deficientes en AGPAT2, determinamos la composición lipídica de preparaciones purificadas de MP de adipocitos diferenciados adipogénicamente in vitro y del tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. No encontramos diferencias en los niveles de colesterol, esteroles y esfingolípidos entre células Agpat2-/- y wild type en el día 0 de diferenciación (cuando las células corresponden a preadipocitos), pero sí mayores niveles de fosfatidilglicerol en preadipocitos Agpat2-/- . En el día 10 de diferenciación, la MP de los adipocitos Agpat2-/- presentó mayor abundancia de fosfatidilserina y 8(9)-dehidrocolesterol. En la MP del tejido adiposo pardo interescapular de ratones recién nacidos, no encontramos diferencias en los niveles de colesterol entre genotipos, pero sí mayores niveles de zimosterol y FFMAS en ratones Agpat2-/- . Por lo tanto, con nuestros resultados podemos concluir que el número reducido de caveolas en adipocitos Agpat2-/- se asocia a niveles elevados de fosfatidilglicerol en el estado de preadipocito (día 0 post inducción adipogénica) y niveles elevados de fosfatidilserina en el estado de adipocito (día 10 post inducción adipogénica). Además, es posible que alteraciones en la distribución celular de caveolina-1 y cavina-1 contribuyan al déficit en el número de caveolas. Estas alteraciones podrían conducir a un tráfico anormal de colesterol, que determina la presencia de acúmulos intracelulares de este lípido y mayor actividad biosintética de colesterol, producto de su retención en compartimentos que previenen su destinación normal a la membrana del RE. Por otro lado, la deficiencia de caveolas podría promover o facilitar la muerte celular lipotóxica de los adipocitos Agpat2-/- , producto de su mayor sensibilidad a ácidos grasos y también por la acumulación excesiva de depósitos intracelulares de colesterol.
Detection of electrophysiological patterns of declarative memory reactivations during sleep
(2021) Sánchez Corzo, Andrea del Pilar; Sitaram, Ranganatha; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Disfunción mitocondrial en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C : contribución del aumento de colesterol mitocondrial mediado por MLN64.
(2015) Balboa Castillo, Elisa Ivana; Zanlungo Matsuhiro, Silvana; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) se caracteriza por la acumulación lisosomal de colesterol, presencia de estrés oxidativo y muerte celular. Los tejidos más afectados son el cerebro y el hígado. Hasta la fecha, no se ha determinado el o los mecanismos que producen la muerte celular en estos tejidos. Para tratar de entender estos mecanismos y dado que se ha demostrado la contribución del daño mitocondrial en otras enfermedades neurodegenerativas y con daño hepático nosotros proponemos estudiar el funcionamiento y la dinámica mitocondrial en modelos NPC y evaluar la contribución de la disfunción mitocondrial en el daño celular observado en la enfermedad. Las mitocondrias son esenciales para la integridad celular, por lo que su dinámica está estrechamente regulada. La dinámica mitocondrial abarca procesos de fusión, fisión, biogénesis y autofagia. En las células NPC se ha observado que existe un mayor contenido de colesterol en la membrana mitocondrial y que procesos importantes de la mitocondria están alterados, como la síntesis de ATP y la entrada de GSH a la mitocondria. Se ha descrito además alteraciones en la morfología mitocondrial en tejidos NPC. Nuestra hipótesis es que el aumento de colesterol en la membrana mitocondrial produce disfunción mitocondrial en las células NPC. Además proponemos que la proteína MLN64 mediaría el transporte de colesterol a las mitocondrias en células NPC. En conjunto estas alteraciones convergerían en una reducción en la producción de energía, aumento en la producción de ROS y en la demanda de energía de las células NPC.El objetivo principal de este trabajo es evaluar si el aumento de colesterol, mediado por la proteína MLN64, contribuye a la disfunción mitocondrial y su relevancia en la patogenia de la enfermedad NPC. Para evaluar esto en diferentes modelos modulamos los niveles de expresión de MLN64 y evaluamos la función mitocondrial en diferentes modelos celulares y en tejidos del ratón Npc1-/-. Para mejorar la función mitocondrial en células NPC y ratones Npc1-/- usamos GSH-EE como antioxidante y Piracetam, una droga que estimula la producción de ATP. Nuestros resultados muestran, en diferentes modelos celulares NPC, disminución en el potencial de membrana, aumento de la producción de superóxido mitocondrial, disminución de GSH y alteraciones en la morfología mitocondrial en comparación con las células control. Las alteraciones en la morfología se relacionaron con disminución y aumento en los niveles de la proteína de fusión MFN2 y a de la proteína de fisión FIS1, respectivamente. En el hígado de ratones Npc1-/- encontramos disminución en la actividad de la ATPasa lo que se relacionó con un aumento significativo en el contenido de colesterol mitocondrial.El tratamiento con Piracetam previno la pérdida del PMM y el aumento de producción de superóxido mitocondrial en células tratadas con U18, pero en ratones Npc1-/- no tuvo efectos positivos. El tratamiento con GSH-EE previno la pérdida de peso en ratones Npc1-/- hasta las 8 semanas. Sin embargo, no tuvo efectos positivos en el comportamiento locomotor y en la sobrevida. Las células NPC y el hígado del ratón Npc1-/- presentaron aumento de la expresión de MLN64. Al disminuir los niveles de MLN64 en células NPC se previno la pérdida del potencial de membrana y disminuyeron los niveles de ROS mitocondrial. En el hígado de los ratones Npc1-/- la disminución de MLN64 provocó disminución del contenido de colesterol libre total y sorprendentemente un aumento en el contenido de colesterol mitocondrial. Por otra parte, en las células que sobreexpresan MLN64 encontramos alteraciones en la función mitocondrial y cambios en la morfología mitocondrial, estos últimos, asociados a disminución en la expresión de MFN2. La sobreexpresión de MLN64 en hígado de ratones produjo un aumento significativo en los niveles de colesterol mitocondrial, disminución en la actividad de la ATPasa, alteraciones en el consumo de oxígeno, disminución en el contenido de GSH mitocondrial y disminución de MFN2.Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que existen alteraciones en la función mitocondrial en la enfermedad NPC y sugieren que MLN64 estaría involucrado en estas alteraciones, ya que la sobreexpresión de MLN64, produce alteraciones en la función y dinámica mitocondrial similares a las observadas en modelos NPC. En este trabajo por primera vez se demostró que la expresión de MLN64 está aumentada en modelos NPC, lo que podría constituir un mecanismo patogénico en la enfermedad NPC. Los resultados obtenidos y antecedentes de la bibliografía sugieren que MLN64 participaría en la homeostasis celular del colesterol y favorecería la acumulación de colesterol en la mitocondria en la enfermedad NPC. La función de la proteína MLN64 no ha sido completamente dilucidada y no se puede descartar que MLN64 regule la función de otras proteínas transportadoras de colesterol que pueden favorecer el transporte de colesterol a la mitocondria. Las conclusiones de este trabajo es que en modelos NPC existen alteraciones en la función y en la morfología mitocondrial. Estas alteraciones estarían relacionadas a un aumento del contenido de colesterol mitocondrial mediado por MLN64 y a cambios en la expresión de proteínas reguladoras de los procesos de fusión y fisión mitocondrial. La importancia de este trabajo es que se demuestra que existe disfunción mitocondrial en la enfermedad de NPC y que esta disfunción podría estar relacionada al aumento de colesterol mitocondrial y al aumento de expresión de MLN64.
Dynamics of cortical computations underlying attentive states
(2021) Medel Sierralta, Vicente; Ossandón, Tomás; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Spontaneous fluctuations occur at different spatial and temporal scales in the brain. Depending on its scale, these activities can show characteristic hallmarks. From a mesoscale perspective, in spontaneous conditions, cortical neurons fire action potentials in a seemingly stochastic manner, which extrapolated to an entire population shows a dynamical state coined as the asynchronous irregular state. Interestingly, when a local population of balanced excitation and inhibition is recurrently connected, the asynchronous population generates a baseline of stochastic perturbation over the neuron’s membrane potential of that local population. These perturbations have been proposed as optimal for information computation and are associated with different states of attention at the behavioral level. Specifically, Locus-Coeruleus Noradrenergic (LC-NE) neuromodulation -which regulates brain states- has been highly implicated in the modulation of desynchronized activity. In this dissertation, we will use a modeling-driven analysis of attentional modulation of local electrophysiological desynchronization, hypothesizing that LC-NE neuromodulation shapes desynchronized background state and the balance between excitation and inhibition. We will show how the complexity of the electrophysiological signals depends on the excitation-inhibition balance of cortical activity, how it tracks behavioral performance, and how it can be related to LC-NE activity and arousal-related neuromodulation. Finally, we show how this complexity fluctuates at different spatial scales with low-dimensionality in attention, and how it is tracked by pupil diameter fluctuations -a non-invasive proxy of LC-NE activity and arousal- in a visuospatial working memory task in humans.
Dysbiosis prevents age-dependent phenotypes in drosphila Pink1B9 a fly model for parkinson's disease
(2022) Molina Mateo, Daniela Francisca; Campusano Astorga, Jorge Mauricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
La interacción entre el sistema nervioso entérico (SNE) y el sistema nervioso central (SNC), comúnmente conocido como el eje Intestino-Cerebro, consiste en una comunicación bidireccional regulada a nivel endocrino, inmunológico y neuronal, el desequilibrio en su normal funcionamiento se ha asociado recientemente con varios trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos. La investigación sobre este eje podría ofrecernos nuevos blancos terapéuticos para una amplia gama de enfermedades, incluida la enfermedad de Parkinson (EP). La EP es un desorden neurodegenerativo caracterizado por alteraciones motoras, las cuales son precedidas por lo que se denomina una etapa prodrómica o premotora donde es posible observar síntomas no motores. En esta tesis se propone manipular la microbiota intestinal en etapas premotoras tempranas de un modelo de EP en mosca generado por una deleción en el gen Pink1 (Pink1B9), para evaluar si esta manipulación podría afectar la progresión temporal de los síntomas de la EP. En este trabajo, se analizó si existían diferencias en la composición de la microbiota del intestino medio a los 8-9 días posteriores a la eclosión y se generó un modelo de disbiosis (desequilibrio microbiano) intestinal en Drosophila mediante un tratamiento crónico con antibiótico (kanamicina, 0,5 mM), durante un máximo de 16 días. Finalmente, mediante el uso de un sistema de registro, evaluamos individualmente en moscas macho diversos parámetros de comportamiento motores y no motores en las moscas tratadas y no tratadas con kanamicina. Los resultados obtenidos en esta tesis evidencian una diferencia sustancial en la composición de la microbiota intestinal del mutante Pink1B9 en comparación con las moscas control. Los datos también muestran que el tratamiento con kanamicina induce la recuperación de algunos de los parámetros no motores en etapa premotora estudiados en la EP, mientras que no hay cambios en los parámetros locomotores en la etapa. Por otro lado, el tratamiento específicamente durante la etapa premotora tiene un efecto prolongado induciendo una mejora en la capacidad locomotora de las moscas de control y mutantes.
Dysfunction in striatal dopaminergic and oxytocinergic system on impulsive choice behavior
(2021) Moreno Fernández, Macarena Gipsy; Fuentealba Evans, José Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Una medida clave de la elección impulsiva implica la preferencia por un refuerzo más pequeño pero entregado de inmediato frente a recompensa más grande asociada con un retraso en su entrega. Este tipo de conducta está presente en varios trastornos neuropsiquiátricos, que incluyen: trastornos de la personalidad, trastorno por déficit atencional e hiperactividad y adicción. En los últimos años se ha propuesto que todas estas patologías comparten una alteración en la transmisión dopaminérgica mesencefálica, pero los mecanismos fisiológicos que acompañan la expresión de la elección impulsiva no están completamente aclarados. Además, hallazgos recientes sugieren que oxitocina (OXT), puede modular varios comportamientos relacionados con el sistema dopaminérgico y que existe una modulación bidireccional entre estos sistemas. El presente estudio tuvo como objetivo investigar: (1) La dinámica dopaminérgica basal en el estriado dorsolateral (SDL) presente en las diferencias individuales de las conductas de elección impulsiva. (2) El rol del sistema oxitocinérgico sobre la transmisión dopaminérgica nigro-estriatal y su modulación en las conductas de elección impulsiva. Los resultados mostraron que: (1) La liberación de dopamina (DA) en el SDL es mayor en animales altamente impulsivos que en animales menos impulsivos, a pesar de que los niveles extracelulares de DA y la actividad del transportador de DA (DAT) no varían entre los grupos. (2) La activación bilateral de OXT-R en substancia nigra pars compacta (SNpc), induce una disminución en la conducta impulsiva, principalmente en animales clasificados previamente como altamente impulsivos. Este hallazgo muestra que la liberación de DA en el SDL está aumentada en las ratas clasificadas como altamente impulsivas, lo que sugiere que la vía nigro-estriatal hiperactiva contribuye a la elección impulsiva. Por otro lado, la activación del OXT-R en la SNpc influye en la toma de decisiones relacionadas con el retraso, mediante cambios sutiles en la transmisión dopaminérgica estriatal. Estos resultados proponen una nueva línea de investigación sobre los mecanismos neurobiológicos que subyacen a la posible interacción entre los sistemas de DA y OXT, y su rol en conductas de elección impulsiva presentes en patologías asociadas a una alteración de estos dos sistemas en la vía nigro-estriatal.
Efecto de la exposición a cigarrillo sobre la funcionalidad de las células de Paneth y su importancia en el desarrollo y progresión de la enfermedad de Crohn
(2018) Berkowitz Fiebich, Loni; Álvarez Lobos, Manuel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
Las células de Paneth son células epiteliales especializadas del intestino delgado. Poseen múltiples gránulos secretorios, ricos en péptidos bactericidas, que son fundamentales para controlar el crecimiento de microorganismos y mantener la homeostasis intestinal. Alteraciones en su funcionamiento se han asociado a desbalances en la microbiota y a procesos inflamatorios intestinales, como la Enfermedad de Crohn (EC). La EC es un desorden inflamatorio crónico del intestino, cuya etiología no está clara, pero se ha postulado que individuos genéticamente susceptibles desarrollarían una respuesta inmune inadecuada contra su microbiota intestinal. Diversos estudios han demostrado que el consumo de cigarrillo, el principal factor de riesgo ambiental para la EC, puede afectar la barrera mucosa del intestino delgado, pero aún no se conoce su impacto a nivel de células de Paneth. En esta tesis nos propusimos evaluar el impacto de la exposición a cigarrillo en la integridad y funcionalidad de las células de Paneth en ratones, y explorar la posible asociación de este efecto en la presentación de la EC en pacientes. Para esto, se implementó un modelo murino de exposición a cigarrillo que genera inflamación intestinal, por medio de la administración intragástrica de Condensado de Humo de Cigarrillo (CHC). Los resultados de esta tesis muestran que el tratamiento con CHC no altera la cantidad ni la distribución de los gránulos de las células de Paneth, ni tampoco el número de estas células por cripta. Sin embargo, la exposición a CHC generó un aumento significativo en el número de gránulos inmaduros, junto a un aumento en el número de células secretoras intermedias presentes en las criptas, sugiriendo la existencia de un proceso regenerativo. Por otro lado, el tratamiento con CHC produjo una reducción significativa en la expresión génica de criptidina-1, criptidina-4 y regIIIγ, tres de los principales péptidos bactericidas expresados por las células de Paneth. Por inmunofluorescencia pudimos observar que las principales diferencias en la expresión de RegIIIγ, recaen a nivel de las vellosidades y no a nivel de criptas, sugiriendo que el CHC pudiera estar dañando diversas células del epitelio intestinal. Además, observamos que los ratones expuestos a CHC son más susceptibles a responder de forma patológica frente a la inoculación con una cepa de S. Typhimurium no virulenta, y presentan cambios significativos en la composición de su microbiota intestinal. Esto permite concluir que una peor capacidad bactericida intestinal, como resultado de alteraciones en las células de Paneth y del resto del epitelio tras la exposición a CHC, puede contribuir al desarrollo de disbiosis y de inflamación intestinal. Para evaluar si estas alteraciones pudieran contribuir en el desarrollo de la EC, se evaluó el impacto de la exposición a CHC en ratones IL-10-/- susceptibles a desarrollar una enterocolitis crónica. Los resultados demuestran que la alteración en la homeostasis intestinal causada por el CHC en ratones genéticamente susceptibles, puede resultar en una enterocolitis sintomática con una inflamación exacerbada, similar a los que ocurre en pacientes con EC. Sin embargo, el impacto no pudo ser atribuido a alteraciones en las células de Paneth, ya que los ratones IL-10-/- presentaron basalmente alteraciones en estas células, independientemente del tratamiento. Por último, se exploró el impacto del consumo de cigarrillo en la integridad de las células de Paneth en humanos, y su asociación con la gravedad de la EC. De acuerdo a los resultados, no fue posible asociar el consumo de cigarrillo a alteraciones en estas células, ni tampoco a una mayor gravedad de la enfermedad. La gran variabilidad observada en los parámetros analizados demuestra la necesidad de modificar los criterios de clasificación, y de aumentar significativamente el número de sujetos reclutados. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis avalan la participación del cigarrillo en la pérdida de la homeostasis intestinal y en la reducción de su capacidad bactericida, reforzando la relevancia de la interacción microbiota-hospedero en el origen de patologías inflamatorias, como la EC.
Efectos de la hipercolesterolemia materna suprafisiológica sobre el tráfico de colesterol en la placenta humana.
(2020) Fuenzalida Saavedra, Bárbara; Leiva Mendoza, Andrea Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
Un aumento en el colesterol materno ocurre en embarazos para asegurar el desarrollo fetal, denominado como hipercolesterolemia materna fisiológica (nombrado en esta tesis como control (C)). La hipercolesterolemia materna suprafisiológica (la que en esta tesis consideraremos como hipercolesterolemia (HC)) ocurre por mecanismos desconocidos y conduce a disfunción endotelial, estrés oxidativo y ateroesclerosis en la vasculatura feto-placentaria, fenómenos que no se asocian a un aumento en los niveles de colesterol en la circulación fetal, sugiriendo que podría existir regulación del tráfico de colesterol entre la circulación materna y la fetal. El tráfico de colesterol en la placenta, definido como captación y eflujo de este lípido desde la circulación materna a la fetal, ocurre específicamente en las células del sincitiotrofoblasto y las células endoteliales de la placenta, en la denominada barrera placentaria. En las células del sincitiotrofoblasto, el colesterol se capta desde las lipoproteínas maternas de baja (LDL) y alta (HDL) densidad principalmente por el receptor de LDL (LDLR) y el receptor de HDL (SR-BI), respectivamente. Posteriormente, el colesterol es entregado a diferentes aceptores a través de un mecanismo de eflujo (salida de colesterol) mediado principalmente por los transportadores de la super-familia de transportadores ABC (ATP binding cassette) tipo A1 (ABCA1) y G1 (ABCG1) y eventualmente SR-BI. Si bien los aceptores clásicos de colesterol para estos transportadores son del tipo HDL, los aceptores en la placenta humana no han sido descritos. Finalmente, el colesterol que ha salido del sincitiotrofoblasto se transporta a las células endoteliales y desde allí a la circulación fetal. Dado que los niveles de colesterol en la circulación fetal son similares en C y en HC y que en distintos modelos de estudio la expresión de los receptores de lipoproteínas y transportadores de colesterol es regulada en respuesta a niveles elevados de colesterol, proponemos que la HC podría modificar la expresión y actividad de LDLR, SR-BI, ABCA1 y ABCG1, y de esta forma, el tráfico de colesterol en las células del sincitiotrofoblasto. Basado en esta información, nuestra hipótesis de trabajo es: La hipercolesterolemia (HC) altera el tráfico de colesterol en células del sincitiotrofoblasto de la placenta humana disminuyendo la captación y el eflujo de este lípido hacia lipoproteínas fetales. Para evaluar la hipótesis, nuestros objetivos generales son: (1) determinar si la HC modifica la captación de colesterol en células del sincitiotrofoblasto de placentas humanas, (2) determinar si la HC modifica el eflujo de colesterol en células del sincitiotrofoblasto de placentas humanas, (3) determinar si la HC modifica el contenido de colesterol en tejido placentario y células del sincitiotrofoblasto de placentas humanas. Los resultados obtenidos muestran que tanto en el sincitiotrofoblasto de placentas HC de término como en cultivos primarios de células del sincitiotrofoblasto purificados desde estas placentas, la captación de LDL-DiI y HDL-DiI estarían disminuidos (DiI: 1,1’-Dioctadecil3,3,3’,3’-Tetrametilindocarbocianina perclorato). Si bien la abundancia proteica de LDLR no cambia, proponemos que su disponibilidad en la membrana celular es menor en sincitiotrofoblasto de placentas HC y de esta forma su función estaría disminuida. En células HC, la abundancia de SR-BI es menor, lo que también se asoció con una disminución en la captación de HDL marcadas. Adicionalmente, determinamos que SR-BI no participa en el eflujo de colesterol en células del sincitiotrofoblasto, que la salida de colesterol hacia ApoA-I es mayor en placentas HC sin cambios en la abundancia proteica de ABCA1 y que la salida de colesterol hacia HDL es menor en células HC posiblemente por una menor abundancia proteica de ABCG1. Por otra parte, en tejido placentario de embarazos con HC y en células purificadas desde estas placentas determinamos que el contenido de colesterol no esterificado (colesterol libre) es mayor que en la condición C. Determinamos también que en células HC esto no se asociaría con una mayor biosíntesis de colesterol ya que la expresión de HMGCR, enzima limitante para la síntesis de colesterol, es menor en células HC. En este modelo celular, la expresión de ACAT1, enzima que esterifica colesterol, está disminuida en células HC; lo que sugerimos se asocia al aumento determinado en la concentración de colesterol libre en células HC. En el modelo de sincitiotrofoblasto sembrados en Transwell® recubiertos con matrigel, determinamos la localización de los receptores y transportadores de colesterol, corroborando lo observado en sincitiotrofoblasto en placentas, sin embargo, no fue posible determinar la direccionalidad del eflujo (hacia polo apical o basal) debido a inconvenientes técnicos y alguna interacción colesterol-matrigel que evitaría la salida de colesterol hacia el compartimento basal. La conclusión de esta tesis es que en embarazos HC, en los que la madre presenta niveles elevados de colesterol, existiría regulación de la abundancia proteica, localización y/o función de receptores de lipoproteínas y transportadores de colesterol. En células del sincitiotrofoblasto aisladas de placentas HC sugerimos que la captación de lipoproteínas y el eflujo de colesterol está disminuido, junto a cambios en los niveles intracelulares de colesterol no esterificado y menor viabilidad celular. Todos estos cambios, se asocian con niveles de colesterol dentro de rangos normales en los hijos de estas mujeres. Proponemos de esta forma, que en el sincitiotrofoblasto de placentas HC se regula el tráfico del colesterol, posiblemente para evitar la entrada exacerbada de este lípido hacia la circulación fetal.

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