3.06 Tesis doctorado
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- ItemCharacterization of the Enterobacteriaceae-associated ROD21-like family of excisable genomic islands and study of excision in the pathogenicity island ROD21(2021) Piña Iturbe, Luis Alejandro; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLas islas genómicas (IGs) son elementos adquiridos horizontalmente que juegan un papel importante en la evolución del genoma y la adaptación bacteriana a diferentes ambientes, ya que estos elementos transfieren genes que codifican diferentes funciones ventajosas para la bacteria, por ejemplo: la capacidad de metabolizar nuevos sustratos, la resistencia a los antimicrobianos o la virulencia, entre otras. Además de estas funciones, muchas IGs también contienen un módulo de escisión/integración que incluye los genes que codifican la maquinaria molecular (la enzima integrasa y el factor de direccionalidad de recombinación) y las regiones reguladoras necesarias que promueven una reacción de recombinación específica de sitio. Esta reacción da como resultado la escisión de la isla del cromosoma como un elemento circular que puede ser el sustrato para la transferencia por conjugación o puede reintegrarse. De manera interesante, se ha encontrado evidencia que el estado escindido/integrado de algunas IGs tiene un rol en la virulencia de las bacterias en su hospedador, aunque por ahora, este fenómeno se ha observado solamente en dos IGs. La creciente disponibilidad de genomas bacterianos secuenciados ha permitido la identificación y caracterización de varias IGs las cuales han sido clasificadas en diferentes familias que comparten un set conservado de genes implicados en los procesos de transferencia y escisión, que comparten vías reguladoras comunes. La identificación y clasificación de las IGs permite comprender mejor su evolución, sus interacciones con su hospedador y los mecanismos reguladores que rigen su transferencia a otras bacterias. Sin embargo, muchas IGs aún no han sido clasificadas y la comprensión de su biología sigue siendo limitada. La Región de Diferencia 21 (ROD21, por sus siglas en inglés) es una isla de patogenicidad escindible y movilizable que codifica algunos factores de virulencia involucrados en la infección producida por Salmonella enterica serovar Enteritidis, un patógeno transmitido por alimentos y una de las serovariedades de Salmonella de mayor prevalencia en el mundo. Los experimentos realizados con cepas mutantes de Salmonella ser. Enteritidis que tienen una capacidad reducida o alterada para escindir ROD2, mostraron un defecto en estas cepas para invadir órganos internos en el modelo murino de infección. Un resultado que puede estar relacionado con los cambios observados en la expresión de los genes en ROD21 y en otros loci genómicos. Sin embargo, aunque la escisión de ROD21 tiene un rol en la virulencia de Salmonella ser. Enteritidis, se conoce muy poco acerca de la regulación de este proceso. ROD21 también está presente en los serovares Gallinarum y Dublin, y aunque se ha reportado la existencia de “islas relacionadas con ROD21”, no se conoce más acerca de este tema. En esta Tesis Doctoral, se utilizaron diferentes herramientas bioinformáticas para identificar islas relacionadas con ROD21 y analizar su filogenia y contenido genético. Estos análisis revelaron que ROD21 pertenece a una familia de islas genómicas presentes en diferentes cepas de bacterias patógenas de plantas y animales del orden Enterobacterales, la cual fue denominada Enterobacteriaceae-associated ROD21-like (EARL). El análisis filogenético sugiere que la familia EARL se originó en bacterias patógenas de plantas y que la adquisición de genes específicos permitió su diseminación a diversos hospedadores bacterianos. Se encontró también que, si bien estas islas codifican grupos de genes variables y conservados, el módulo de escisión/integración fue la única región conservada en las 56 islas identificadas, incluida ROD21, hallazgo que destaca la naturaleza escindible de la familia EARL como se demostró para dos de sus miembros albergados por Klebsiella pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos cepa KP35 y Escherichia coli enteropatógena O127:H6 cepa E2348/69. Cabe destacar que las islas EARL poseen genes que codifican homólogos cortos y de longitud completa del regulador transcripcional global H-NS, una proteína involucrada en la regulación de funciones bacterianas importantes como la virulencia y la transferencia horizontal de genes. Como parte del módulo de integración /escisión conservado, se caracterizaron el gen SEN1998 y su producto proteico purificado para evaluar su rol en la escisión de ROD21. Si bien SEN1998 codifica un factor de direccionalidad de recombinación capaz de unirse a las regiones de ADN involucradas en el proceso de escisión, la deleción de este gen solo produjo una ligera reducción en el nivel de escisión. Sorpresivamente, los niveles de expresión de SEN1998 resultaron estar correlacionados negativamente con la escisión de ROD21, una característica que también se observó para el gen SEN1970 que codifica la integrasa. A pesar de estos hallazgos, no está claro si la represión de SEN1998 y SEN1970, la cual ocurrió inmediatamente antes que comenzara a aumentar la escisión, está relacionada a la regulación de este proceso. En resumen, los resultados de esta Tesis amplían el repertorio de islas genómicas escindibles identificadas, presenta información sobre su evolución y proporciona un primer acercamiento a la comprensión de la regulación de la escisión en la isla de patogenicidad ROD21. Estos hallazgos podrían contribuir a una mejor comprensión de los patógenos actuales y emergentes como lo son las diferentes serovariedades de Salmonella, E. coli patógena y K. pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos, entre otros.
- ItemOpen platform for the implementation of RNA sensing reactions in cell-free systems(2021) Arce Medina, Aníbal Andrés; Federici, Fernán; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa biología sintética busca el desarrollo de funciones programables y predecibles en sistemas biológicos. Uno de los recientes avances en esta área son los toehold swtiches: reguladores de la expresión genética diseñados denovo y que permiten la traducción de un gen de forma gatillada por la interacción con un RNA trigger" de secuencia especifica. Por otro lado, los sistemas de expresión genética libre de células (cell-free) han sido utilizados durante décadas en el campo de la biología molecular y fueron claves en el descubrimiento del código genético. Sin embargo, solo muy recientemente han empezado a utilizarse como una herramienta para la bioingeniería. La expresión de toehold swtiches en sistemas de libre de células generó una plataforma de diagnóstico muy promisoria ya que los sensores de RNA tipo toehold pueden ser liofilizados para su transporte a temperatura ambiente con el objetivo de ser utilizadas en terreno y en zonas remotas. No obstante, a la fecha, estos sensores solamente han sido implementados en sistemas de expresión genética reconstituidos, del tipo PURE (por sus siglas en inglés: Protein expression Using Reconstituted Elements). Los sistemas PURE requieren transporte en fr´ıo (-80 C) desde los proveedores en el hemisferio norte, y son prohibitivamente caros para los usuarios en América Latina.
- ItemTranscriptional attenuation versus rhytmic repression : lessons from an optogenetic TTFL synthetic system in Saccharomyces cerevisiae(2020) Delgado Hernández, Verónica Melissa; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa biología sintética busca develar los principios de diseño de procesos celulares complejos, como las que se encuentran subyacentes en las redes transcripcionales. Un módulo transcripcional interesante para estudiar son los circuitos de retroalimentación negativa transcripcional-traduccional (llamados por sus siglas en ingles TTFL de “Transcriptional-Translational negative Feedback Loop”), como los encontrados en el corazón de los relojes circadianos. Así, nosotros buscamos poder dilucidar los mecanismos subyacentes que gobiernan la topología y dinámica de estos sistemas naturales, empleando componentes del sistema de fotoadaptación de Neurospora crassa en S. cerevisiae como nuestro” chasis” experimental. La arquitectura básica de los TTFLs se asemeja al reloj molecular de N. crassa, el cual está compuesto de un circuito de retroalimentación negativa. Aquí, un módulo positivo activa la expresión del modulo negativo que reprime su propia activación. Por tanto, la topología de este TTFL artificial propuesto emplea proteínas del sistema de fotoadaptación de Neurospora, los cuales se dispusieron como proteínas hibridas: los dominios LOV se fusionaron al factor de transcripción (FT) Gal4, el cual se encuentra dividido en dos partes. Por tanto, el primer capítulo de esta tesis describe la precisa interacción de los dominios LOV solamente en presencia de luz, lo que permite reconstituir el FT Gal4. Este FT es un interruptor transcripcional mediado por luz llamado FUN-LOV. De esta manera fue posible controlar por luz, de forma elegante, dos fenotipos relevantes de la levadura: la floculación y la expresión heteróloga de proteínas, validando el amplio espectro de aplicabilidad de este interruptor sintético. Para construir este TTFL sintético, nosotros analizamos el efecto de expresar diferentes componentes que pudieran regular negativamente a FUN-LOV, permitiendo cerrar el circuito negativo, este nuevo sistema se llamó OptoLoop. El caso en el que se logró obtener los mejores resultados para el OptoLoop fue cuando el activador FUN-LOV controló la expresión de Gal80, el represor natural de la red genética Gal y, que es así capaz de interferir con su propia expresión. Nosotros implementamos este OptoLoop, capaz de responder a luz en células de levadura, siguiendo su funcionamiento a través de la actividad del reportero luciferasa (luc) y el fenotipo de floculación. Por tanto, el segundo capítulo de esta tesis muestra como del OptoLoop genera una atenuación en la respuesta transcripcional del sistema, pero no una respuesta oscilatoria, lo cual se puede explicar por la falta de un “time-delay” dentro del circuito. Adicionalmente, se desarrolló un modelo matemático que establece una relación entre la dinámica y la topología de los TTFL con un time-delay, información de utilidad para diseñar y construir relojes moleculares a futuro. En conjunto, esta aproximación aporta ideas de la topología de los TTFL y osciladores, mientras que contribuye al entendimiento de los mecanismos moleculares del sistema de fotoadaptación en N. crassa.