Transcriptional attenuation versus rhytmic repression : lessons from an optogenetic TTFL synthetic system in Saccharomyces cerevisiae
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2020
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Abstract
La biología sintética busca develar los principios de diseño de procesos celulares complejos, como las que se encuentran subyacentes en las redes transcripcionales. Un módulo transcripcional interesante para estudiar son los circuitos de retroalimentación negativa transcripcional-traduccional (llamados por sus siglas en ingles TTFL de “Transcriptional-Translational negative Feedback Loop”), como los encontrados en el corazón de los relojes circadianos. Así, nosotros buscamos poder dilucidar los mecanismos subyacentes que gobiernan la topología y dinámica de estos sistemas naturales, empleando componentes del sistema de fotoadaptación de Neurospora crassa en S. cerevisiae como nuestro” chasis” experimental. La arquitectura básica de los TTFLs se asemeja al reloj molecular de N. crassa, el cual está compuesto de un circuito de retroalimentación negativa. Aquí, un módulo positivo activa la expresión del modulo negativo que reprime su propia activación. Por tanto, la topología de este TTFL artificial propuesto emplea proteínas del sistema de fotoadaptación de Neurospora, los cuales se dispusieron como proteínas hibridas: los dominios LOV se fusionaron al factor de transcripción (FT) Gal4, el cual se encuentra dividido en dos partes. Por tanto, el primer capítulo de esta tesis describe la precisa interacción de los dominios LOV solamente en presencia de luz, lo que permite reconstituir el FT Gal4. Este FT es un interruptor transcripcional mediado por luz llamado FUN-LOV. De esta manera fue posible controlar por luz, de forma elegante, dos fenotipos relevantes de la levadura: la floculación y la expresión heteróloga de proteínas, validando el amplio espectro de aplicabilidad de este interruptor sintético. Para construir este TTFL sintético, nosotros analizamos el efecto de expresar diferentes componentes que pudieran regular negativamente a FUN-LOV, permitiendo cerrar el circuito negativo, este nuevo sistema se llamó OptoLoop. El caso en el que se logró obtener los mejores resultados para el OptoLoop fue cuando el activador FUN-LOV controló la expresión de Gal80, el represor natural de la red genética Gal y, que es así capaz de interferir con su propia expresión. Nosotros implementamos este OptoLoop, capaz de responder a luz en células de levadura, siguiendo su funcionamiento a través de la actividad del reportero luciferasa (luc) y el fenotipo de floculación. Por tanto, el segundo capítulo de esta tesis muestra como del OptoLoop genera una atenuación en la respuesta transcripcional del sistema, pero no una respuesta oscilatoria, lo cual se puede explicar por la falta de un “time-delay” dentro del circuito. Adicionalmente, se desarrolló un modelo matemático que establece una relación entre la dinámica y la topología de los TTFL con un time-delay, información de utilidad para diseñar y construir relojes moleculares a futuro. En conjunto, esta aproximación aporta ideas de la topología de los TTFL y osciladores, mientras que contribuye al entendimiento de los mecanismos moleculares del sistema de fotoadaptación en N. crassa.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias mención Genética Molecular y Microbiología)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2020