3.06 Tesis doctorado

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Causes and consequences of nitrogen limited chronosequences : evidence from the Andean dry puna.
(2014) Alfaro Ayllón, Fernando Daniel; Marquet, P. A. (Pablo A.); Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Se ha establecido que en ambientes mésicos el cambio en el contenido de nutrientes durante el desarrollo a largo plazo de los suelos determina los cambios en procesos ecosistémicos tales como la productividad primaria y el reciclaje de nutrientes, así como en la composición y diversidad de plantas y microorganismos del suelo. Por lo tanto, suelos jóvenes limitados por Nitrógeno (N) están dominados por plantas de crecimiento rápido y rápida descomposición, y en estados tardíos de desarrollo el Fósforo (P) se vuelve limitante y las especies cambian a estrés-tolerantes, de crecimiento lento y bajas tasas de descomposición. Sin embargo, estudios recientes en ambientes áridos muestran que la limitación por N domina los procesos ecosistémicos, por lo que la trayectoria de desarrollo de los suelos podría ser significativamente distinta a lo observado en regiones mésicas. En este trabajo se evaluaron las causas y consecuencias del desarrollo de los suelos en ambiente áridos limitados por N y su efecto sobre las comunidades de plantas y microorganismos del suelo a lo largo de tres cronosecuencias de c. 20,000 años con suelos derivados a partir de diferente material parental en la Puna seca de los Andes centrales de Bolivia. Los resultados confirman que el N es limitante a lo largo del gradiente de edad, mientras que el P se mantuvo sin cambios, este patrón se mantuvo independientemente del origen geológico de los suelos de las cronosecuencias.El incremento en la razón N:P durante el desarrollo de los suelos determinó los incrementos en la riqueza de especies, la descomposición y la translocación de nutrientes en plantas que se observaron en las tres cronosecuencias. Las comunidades de bacterias y hongos del suelo mostraron patrones contrastantes; la abundancia de bacterias incrementó con la edad de los suelos, pero la abundancia de hongos declinó a lo largo del desarrollo de los suelos, lo que sugiere un cambio en la dominancia microbiana en relación con el cambio en la disponibilidad de nutrientes a lo largo del gradiente de edad de los suelos. En conjunto estos resultados indican que a diferencia de los ambientes mésicos, en ambientes limitados permanentemente por el agua, la limitación por N retarda el desarrollo de los suelos, y de los componentes bióticos sobre y debajo del suelo, manteniendo así a los ecosistemas en un estado de “juventud” permanente.
Control of basal ciliary activity and response to mechanical and chemical stimuli depend on extracellular ATP through an autocrine/paracrine mechanism.
(2014) Droguett Quezada, Karla Denise; Villalón, Manuel J.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En el epitelio mucociliado de las vías respiratorias y del oviducto, la frecuencia de batido ciliar (CBF) es el principal factor que determina la efectividad del transporte mucociliar. CBF se puede medir en un estado basal o incrementada por un estimulo químico o mecánico. ATP es un conocido estimulante de la CBF, efecto que es mediado por la activación de receptores purinérgicos. El incremento en la CBF inducido por ATP depende de la liberación de Ca2+ de almacenes intracelulares y de la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular. En células del epitelio respiratorio, ATP es liberado al medio extracelular de manera constitutiva o en respuesta a una estimulación mecánica (MS), por un mecanismo que involucraría hemicanales (HCs) de panexina 1 (Panx1) o de conexina 43 (Cx43). El objetivo de este estudio fue determinar si ATP liberado por el epitelio mucociliado contribuye en el mecanismo de control de la actividad ciliar basal y si el incremento de la CBF inducido por una estimulación química y mecánica es mediado por la liberación de ATP.
La función de calcio en la vía de señalización mediada por nitrato en raíces de Arabidopsis thaliana /
(2015) Riveras Hernández, Eleodoro Javier; Gutiérrez Ilabaca, Rodrigo Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Entender como las plantas censan y responden a cambios en la disponibilidad de nitrógeno (N) es el primer paso para desarrollar estrategias para aplicaciones biotecnológicas tales como mejorar la eficiencia del uso del nitrógeno. Sin embargo, los componentes involucrados en las vías de señalización de N son pobremente conocidos. Calcio es un segundo mensajero en vías de transducción de señales en plantas pero su rol en la respuesta a nitrato no ha sido evaluado. Usando una planta reportera que expresa la proteína Aequorina, hemos observado que tratamientos con nitrato incrementan la concentración de calcio citoplasmático ([Ca2+]cyt). Encontramos que nitrato también induce un aumento en los niveles de inositol trifosfato (IP3). El incremento en los niveles de IP3 y [Ca2+]cyt en respuesta a nitrato fue bloqueado por U73122, un inhibidor de la actividad de la fosfolipasa C (PLC), pero no por el análogo no funcional U73343. Además, el incremento en los niveles de IP3 y [Ca2+]cyt en respuesta a nitrato fue inhibido en la mutante del receptor de nitrato NRT1.1/AtNPF6.3. La expresión de genes de respuesta nitrato fue severamente afectada por pre-tratamientos con bloqueadores de canales de calcio e inhibidores de la PLC. Estos resultados indican que el calcio actúa como un segundo mensajero en la vía de señalización de nitrato de Arabidopsis thaliana. Nuestros resultados sugieren un modelo en el que NRT1.1/AtNPF6.3 y la actividad de la PLC median el incremento de calcio en respuesta a nitrato, el cual a su vez produce el cambio en la expresión de genes de respuesta a nitrato.
Influencia de colonizadores primarios e interacciones microbianas en el desarrollo de biocorrosión marina sobre acero inoxidable
(2019) DailleEnríquez,LeslieKeiclyn; Iglesia Cabezas, Rodrigo Alonso de la; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La corrosión es un fenómeno electroquímico que afecta toda superficie de metal expuesta a ambientes acuosos o húmedos, produciendo una disolución del metal mediante reacciones de óxido/reducción. Este fenómeno puede verse inducido y/o aumentado por la actividad microbiana, proceso conocido como biocorrosión y es generada por la actividad de microorganismos que se adhieren a la superficie del metal, y que forman una biopelícula cuya actividad metabólica altera las condiciones químicas de la superficie del metal. Se ha establecido que, durante la formación de estas biopelículas, el tipo de microorganismo que coloniza cada superficie está determinado principalmente por el material de la superficie, las características del fluido y los mecanismos de adherencia microbianos. Luego del establecimiento de las primeras especies que colonizan el metal, se produce una sucesión microbiana asociada al desarrollo de interacciones específicas entre los microorganismos y los microambientes de la biopelícula. Esto permite albergar una gran variedad de metabolismos en la biopelícula, como la reducción de sulfato, oxidación de hierro y producción de exopolisacáridos, los que afectan directa o indirectamente la superficie del metal. En ambientes marinos, las condiciones ambientales exacerban el desarrollo de corrosión y la influencia de microorganismos en el proceso. A pesar de la importancia de los microorganismos en biocorrosión marina, aun no es claro quiénes se asientan en la superficie, cómo afectan la constitución de la biopelícula sobre superficies metálicas y de qué depende su capacidad corrosiva. En este proyecto de Tesis, se propone que los colonizadores primarios que se asientan sobre superficies de acero inoxidable en ambientes marinos, y las interacciones que ellos establecen, son determinantes para el desarrollo de biocorrosión. Para confrontarla se propone determinar la estructura y composición de la comunidad microbiana que se genera durante el desarrollo de una biopelícula corrosiva -con énfasis en las primeras etapas de colonización- y analizar las interacciones bióticas y abióticas que se establecen al ser inducido el proceso de corrosión sobre el acero inoxidable. Para abordar este objetivo, se diseñó un modelo experimental que permite la exposición de placas de acero inoxidable a un flujo continuo de agua de mar natural. El desarrollo de la biopelícula fue evaluado mediante el análisis de una serie de tiempo de 15 puntos contenidos en tiempos tempranos (0,125 días, 0,25 días, 0,375 días, 0,5 días, 0,75 días, 1 días), medios (2 días, 3 días, 5 días, 7 días), y tardíos (21 días, 30 días, 55 días, 85 días y 112 días) de exposición. En cada punto de esta serie de tiempo, se determinó la composición taxonómica de la biopelícula, incluyendo bacterias, arqueas y eucariontes. Para ello, se utilizó secuenciación masiva de los genes de las subunidades ribosomales 16S rRNA y 18S rRNA respectivamente. Esta información se integró analizando patrones de co-ocurrencia e interacciones que se establecen en la biopelícula, durante el proceso de biocorrosión. Se determinó en paralelo el comportamiento electroquímico de las placas y los niveles de deterioro del material establecidos a través de pérdida de peso. Los resultados obtenidos indican que la colonización primaria de la superficie comenzó por asociación con las imperfecciones del material y que estuvo compuesta no solo por bacterias, sino también por eucariontes fotosintéticos, eucariontes heterótrofos y arqueas. Entre ellos encontramos principalmente Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Archaeplastida y Opisthokonta. Se observó que el asentamiento de microorganismos eucariontes previamente relacionados con corrosión, como diatomeas, se favorece durante la primera semana de exposición a través de la interacción con sectores previamente colonizados por microorganismos. Además, a los 7 días, se determinó un máximo en la conectividad entre el componente eucarionte y bacteriano. Durante tiempos tardíos de exposición, la composición microbiana presenta cambios, donde se destaca un aumento de Alphaproteobacteria, Firmicutes y Plactomycetes. Finalmente, se produjo una saturación del espacio disponible, la comunidad presentó menor riqueza, mayor equidad, y mayor abundancia de las especies que dominan en las redes de co-ocurrencia inferidas. Por otro lado, los análisis electroquímicos y de deterioro del material mostraron que, durante tiempos tempranos y medios de exposición, se produjo un ennoblecimiento de la superficie de la placa, lo que sugiere susceptibilidad al desarrollo de corrosión por picadura. Posteriormente, durante tiempos tardíos de exposición, se observó un desplazamiento del potencial desde +200 mVvs Ag/AgCl hacia -200 mVvs Ag/AgCl, valor en el cual se mantiene hasta el final del experimento. Se determinó mayor deterioro del material luego de este periodo. Los valores de OCP mencionados y un aumento significativo de la corriente de corrosión durante el experimento sugieren, en conjunto, una activación de la superficie dada por un aumento en la transferencia de electrones. Los resultados apoyan parcialmente las hipótesis planteadas, principalmente por la relación entre colonizadores primarios, el asentamiento de diatomeas y las potenciales interacciones ecológicas entre bacterias y eucariontes heterótrofos. En este trabajo se muestra la importancia del estudio del desarrollo de la sucesión biológica y las interacciones biológicas que tienen lugar, para entender el desarrollo de corrosión en acero inoxidable en ambientes naturales. En conjunto han permitido la propuesta de un modelo conceptual y la formulación de nuevas hipótesis que nos ayuden a entender el fenómeno de biocorrosión marina con miras a nuevas estrategias de prevención y control que sean amigables con el medioambiente.
Mechanisms involved in the loss of brown adipose tissue in the AGPAT2 deficient mouse.
(2019) Tapia Ossa, Pablo José; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que participa en la síntesis de triacilgliceroles y glicerofosfolípidos. En la diferenciación de adipocitos (adipogénesis) el almacenamiento de lípidos en gotas lipídicas de los adipocitos tiene un rol fundamental. Mutaciones en el gen codificante para esta enzima generan lipodistrofia congénita generalizada, enfermedad caracterizada por la reducción severa de tejido adiposo blanco y pardo, así como también severas complicaciones metabólicas. Los ratones deficientes para AGPAT2 (Agpat2-/-) nacen con tejido adiposo pardo de morfología y abundancia similar al de ratones normales, sin embargo, este tejido degenera completamente durante los primeros 6 días después de nacer. Las causas de este fenómeno son actualmente desconocidas. La hipótesis de esta tesis es que adipocitos pardos de ratones Agpat2-/- tienen anormalidades transcripcionales que determinan adipogénesis defectuosa y mayor susceptibilidad a muerte celular lipotóxica. Para evaluar esta hipótesis, preadipocitos pardos del tejido adiposo interescapular de ratones Agpat2-/- y tipo silvestre fueron diferenciados adipogénicamente en cultivo celular y comparados en diversos parámetros morfológicos y moleculares. Los cultivos de preadipocitos diferenciados Agpat2-/- presentaron una menor proporción de células cargadas con gotas lipídicas a lo largo de la diferenciación y una expresión disminuida de los reguladores transcripcionales pro-adipogénicos PPARy, PPARα, C/EBPα y PGC1α. Importantemente, los factores de transcripción PRDM16 y C/EBPβ, previamente identificados como mediadores de la diferenciación adipogénica parda, tuvieron niveles normales en los adipocitos pardos Agpat2- /- diferenciados in vitro. Concordantemente, la proteína UCP1, un marcador específico de adipocito pardo maduro, permaneció indetectable en los adipocitos Agpat2-/- diferenciados. Por el contrario, sus niveles fueron fuertemente inducidos en los adipocitos pardos tipo silvestre diferenciados in vitro. El análisis ultraestructural de los adipocitos diferenciados mostró que las mitocondrias de los adipocitos Agpat2-/- diferenciados pardos tienen morfología notoriamente alterada, con crestas de geometría irregular, y una menor asociación física con gotas lipídicas, a diferencia de lo que ocurre en los adipocitos pardos normales diferenciados, que tienen mitocondrias con crestas plegadas en disposición paralela y que están íntimamente asociadas a gotas lipídicas con alta frecuencia. El análisis global del transcriptoma de los adipocitos diferenciados in vitro mostró divergencia significativa en la abundancia del mRNA codificado por varios grupos de genes. Entre estas destacaron, menor expresión de genes relacionados a la acumulación de lípidos y estructura y función mitocondrial, y mayor expresión de genes estimulados por interferón. Estos resultados fueron verificados independientemente por análisis de qRT-PCR. Adicionalmente, los cultivos de adipocitos Agpat2-/- diferenciados presentan menores niveles de Elovl3 y mitoNEET, ambos previamente identificados como reguladores de la diferenciación y función adiposa. Importantemente, la sobreexpresión de estas proteínas por medio de vectores adenovirales, no normalizó la acumulación de gotas lipídicas en adipocitos Agpat2-/- diferenciados, indicando que la diferenciación adipogénica defectuosa dependiente de la carencia de AGPAT2 no es revertida por estos productos génicos. Finalmente, para evaluar la mayor susceptibilidad a muerte celular por lipotoxicidad en adipocitos pardos Agpat2-/-, primero se cuantificó la concentración y composición de ácidos grasos en el plasma de ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con ratones tipo silvestre de la misma edad, mostrando una elevación marcada de todas las clases de ácidos grasos, en particular saturados y monoinsaturados, a partir del segundo día postnatal. Entre los primeros destacó el ácido palmítico, cuya concentración fue ~5 veces mayor en los ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con el tipo silvestre. La incubación de preadipocitos no diferenciados Agpat2-/- y tipo silvestre con ácido palmítico, mostró similares niveles de muerte celular causada por lipotoxicidad. Sin embargo, cuando adipocitos pardos diferenciados in vitro fueron expuestos a ácido palmítico, los cultivos Agpat2-/- presentaron niveles de muerte celular significativamente mayores, cuantificada por cuatro técnicas distintas y complementarias, en comparación con el tipo silvestre, indicado que la carencia de AGPAT2 determina mayor susceptibilidad de los adipocitos a muerte por lipotoxicidad. Tomados en su conjunto, los resultados de esta tesis indican que AGPAT2 es esencial para la diferenciación adiposa parda, determinando perfiles transcripcionales anormales y que los adipocitos diferenciados carentes de esta enzima son más sensibles a altos niveles de ácidos grasos saturados presentes en los ratones Agpat2-/- después de nacer.
Mechanisms of lipodystrophy in the AGPAT2 deficient mouse
(2013) Cautivo Reyes, Kelly Margarita; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que normalmente se expresa en altos niveles en el tejido adiposo y cataliza la conversión de ácido lisofosfatídico (LPA) a ácido fosfatídico (PA), un paso fundamental en la biosíntesis de triglicéridos y glicerofosfolípidos. Mutaciones que inactivan el gen AGPAT2 causan reducción severa del tejido adiposo, tanto en seres humanos como en ratones, generando una condición patológica conocida como lipodistrofia generalizada. Los mecanismos por los cuales la deficiencia de AGPAT2 causa lipodistrofia son desconocidos. La hipótesis de este trabajo es que la falta de AGPAT2 altera el proceso de diferenciación que convierte a las células precursoras adiposas (preadipocitos) en adipocitos maduros, impidiendo, por lo tanto, la formación y expansión de tejido adiposo en los ratones Agpat2-/-. Para probar esta hipótesis se utilizó un enfoque experimental combinado, in vitro e in vivo. Estudios de adipogénesis in vitro con fibroblastos de embriones de ratón (FERs) reveló que la diferenciación adipogénica es anormal en múltiples niveles en los FERs Agpat2-/-.En primer lugar, la inducción adipogénica resultó en una alta proporción de FERs Agpat2-/- que mueren durante el proceso de expansión clonal mitótica (34 % frente a 6 % en los controles). Esto se tradujo en una proporción significativamente menor de células que progresaron a fases adipogénicas avanzadas y se correlacionó con una reducida activación de la vía de señalización de insulina. En segundo lugar, los FERs Agpat2-/- que lograron diferenciarse presentaron menor tamaño celular, menor contenido de lípidos neutros y gotas lipídicas pequeñas y desorganizadas, las cuales contienen una menor cantidad de Perilipina asociada a su superficie. Además, se observó presencia de múltiples agregados intracelulares de Perilipina no asociada a gotas lipídicas. El análisis de fetos en la última etapa de desarrollo intra uterino y de ratones recién nacidos reveló, inesperadamente, que tanto la masa total de tejido adiposo como su estructura tisular fue normal en estas etapas del desarrollo en ratones Agpat2-/-. Sin embargo, al segundo día después del nacimiento el tejido adiposo de los ratones Agpat2-/- fue rapidamente reemplazado por una elevada proporción de adipocitos en proceso de muerte celular, seguido por una masiva respuesta inflamatoria mediada por macrófagos. Finalmente, al sexto día después del nacimiento, el tejido adiposo fue indetectable en estos ratones, estableciendo un generalizado sindrome lipodistrofico. En resumen, los hallazgos de esta tesis demuestran que AGPAT2 es absolutamente necesaria para la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de los FER, así como para el crecimiento y viabilidad del tejido adiposo en la vida postnatal del ratón.
Restoration of nNOS\03BC function in the MDX mouse model of Duchenne muscular distrophy.
(2013) Rebolledo López, Daniela Victoria; Froehner, Stanley C.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Óxido Nítrico Sintasa Neuronal (nNOS) es una enzima regulada por Ca2+/calmodulina que sintetiza óxido nítrico (ON) desde L-arginina. Existen al menos 4 variantes de splicing para nNOS. nNOS\03BC es una isoforma que posee un inserto de 34 aminoácidos y que es específicamente expresada en músculo esquelético y cardiaco. En el músculo normal, nNOS\03BC se localiza principalmente en el lado citosólico de la membrana plasmática, el sarcolema, por unión a \03B1-sintrofina, un miembro del complejo glicoproteico asociado a la distrofina (DGC). La localización sarcolemal de nNOS\03BC es crítica para oponerse a la vasoconstricción simpática y mantener un flujo sanguíneo apropiado a los músculos activos durante el ejercicio. La expresión, localización sarcolemal y/o la señalización de nNOS\03BC se encuentran alteradas en varias enfermedades neuromusculares, incluyendo la distrofia muscular de Duchenne (DMD). DMD es un desorden devastador ligado al cromosoma X que comienza en la niñez con dificultad para caminar y correr; progresa con la pérdida de la capacidad ambulatoria en la adolescencia temprana, seguido por perdida de la función de brazos, tronco, y fallas cardiacas y respiratorias. La muerte es común en la adultez temprana. DMD, y el desorden alélico menos severo, la distrofia muscular de Becker, se producen por mutaciones en el gen de la distrofina. En éstas y otras distrofias musculares, existe una necesidad crítica y urgente por tratamientos seguros y eficaces para disminuir la progresión de la enfermedad. Tales terapias reducirán la carga de la enfermedad, mejorarán la calidad de vida y otorgarán tiempo hasta que los tratamientos que se dirigen al defecto genético primario estén totalmente desarrollados, sean económicamente alcanzables y ampliamente distribuidos.
El sistema ubiquitina-proteasoma regula el destino de las células troncales musculares.
(2015) Bustos Velásquez, Francisco Juvenal; Olguín Marín, Hugo César; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las células satélite son células troncales adultas tejido específicas del músculo esquelético. Fisiológicamente, estas células son las responsables de la gran capacidad regenerativa observada en el músculo. A nivel molecular, la diferenciación y autorrenovación de las células satélite está controlada por un balance delicado entre los factores regulatorios musculares que promueven la diferenciación y el factor de transcripción Pax7 el cual inhibe este proceso. Pax7 se expresa en las células satélite, sin embargo sus niveles proteicos disminuyen en las células que inician el proceso de diferenciación. Por otro lado, Pax7 es retenido en las células satélite generadas durante el proceso regenerativo por autorrenovación. Junto con esto, se ha demostrado que Pax7 controla la especificación, mantención y función de las células satélite in vitro e in vivo. Dadas las diversas funciones que posee Pax7 en las células satélite, los mecanismos involucrados en la regulación de la expresión de este factor constituyen una interrogante aún no resuelta y que se encuentra en la actual frontera del estudio de la biología de las células satélite.

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