Mechanisms involved in the loss of brown adipose tissue in the AGPAT2 deficient mouse.
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Date
2019
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Abstract
1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que participa en
la síntesis de triacilgliceroles y glicerofosfolípidos. En la diferenciación de adipocitos
(adipogénesis) el almacenamiento de lípidos en gotas lipídicas de los adipocitos tiene un rol
fundamental. Mutaciones en el gen codificante para esta enzima generan lipodistrofia congénita
generalizada, enfermedad caracterizada por la reducción severa de tejido adiposo blanco y
pardo, así como también severas complicaciones metabólicas. Los ratones deficientes para
AGPAT2 (Agpat2-/-) nacen con tejido adiposo pardo de morfología y abundancia similar al de
ratones normales, sin embargo, este tejido degenera completamente durante los primeros 6 días
después de nacer. Las causas de este fenómeno son actualmente desconocidas. La hipótesis de
esta tesis es que adipocitos pardos de ratones Agpat2-/- tienen anormalidades transcripcionales
que determinan adipogénesis defectuosa y mayor susceptibilidad a muerte celular lipotóxica.
Para evaluar esta hipótesis, preadipocitos pardos del tejido adiposo interescapular de
ratones Agpat2-/- y tipo silvestre fueron diferenciados adipogénicamente en cultivo celular y
comparados en diversos parámetros morfológicos y moleculares. Los cultivos de preadipocitos
diferenciados Agpat2-/- presentaron una menor proporción de células cargadas con gotas
lipídicas a lo largo de la diferenciación y una expresión disminuida de los reguladores
transcripcionales pro-adipogénicos PPARy, PPARα, C/EBPα y PGC1α. Importantemente, los
factores de transcripción PRDM16 y C/EBPβ, previamente identificados como mediadores de la diferenciación adipogénica parda, tuvieron niveles normales en los adipocitos pardos Agpat2-
/- diferenciados in vitro. Concordantemente, la proteína UCP1, un marcador específico de
adipocito pardo maduro, permaneció indetectable en los adipocitos Agpat2-/- diferenciados. Por
el contrario, sus niveles fueron fuertemente inducidos en los adipocitos pardos tipo silvestre diferenciados in vitro. El análisis ultraestructural de los adipocitos diferenciados mostró que las
mitocondrias de los adipocitos Agpat2-/- diferenciados pardos tienen morfología notoriamente
alterada, con crestas de geometría irregular, y una menor asociación física con gotas lipídicas, a
diferencia de lo que ocurre en los adipocitos pardos normales diferenciados, que tienen
mitocondrias con crestas plegadas en disposición paralela y que están íntimamente asociadas a
gotas lipídicas con alta frecuencia. El análisis global del transcriptoma de los adipocitos
diferenciados in vitro mostró divergencia significativa en la abundancia del mRNA codificado
por varios grupos de genes. Entre estas destacaron, menor expresión de genes relacionados a la
acumulación de lípidos y estructura y función mitocondrial, y mayor expresión de genes
estimulados por interferón. Estos resultados fueron verificados independientemente por análisis
de qRT-PCR.
Adicionalmente, los cultivos de adipocitos Agpat2-/- diferenciados presentan menores
niveles de Elovl3 y mitoNEET, ambos previamente identificados como reguladores de la
diferenciación y función adiposa. Importantemente, la sobreexpresión de estas proteínas por medio de vectores adenovirales, no normalizó la acumulación de gotas lipídicas en adipocitos
Agpat2-/- diferenciados, indicando que la diferenciación adipogénica defectuosa dependiente de
la carencia de AGPAT2 no es revertida por estos productos génicos.
Finalmente, para evaluar la mayor susceptibilidad a muerte celular por lipotoxicidad en
adipocitos pardos Agpat2-/-, primero se cuantificó la concentración y composición de ácidos
grasos en el plasma de ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con ratones tipo silvestre
de la misma edad, mostrando una elevación marcada de todas las clases de ácidos grasos, en
particular saturados y monoinsaturados, a partir del segundo día postnatal. Entre los primeros destacó el ácido palmítico, cuya concentración fue ~5 veces mayor en los ratones Agpat2-/-
recién nacidos en comparación con el tipo silvestre.
La incubación de preadipocitos no diferenciados Agpat2-/- y tipo silvestre con ácido
palmítico, mostró similares niveles de muerte celular causada por lipotoxicidad. Sin embargo,
cuando adipocitos pardos diferenciados in vitro fueron expuestos a ácido palmítico, los cultivos
Agpat2-/- presentaron niveles de muerte celular significativamente mayores, cuantificada por
cuatro técnicas distintas y complementarias, en comparación con el tipo silvestre, indicado que
la carencia de AGPAT2 determina mayor susceptibilidad de los adipocitos a muerte por
lipotoxicidad.
Tomados en su conjunto, los resultados de esta tesis indican que AGPAT2 es esencial
para la diferenciación adiposa parda, determinando perfiles transcripcionales anormales y que
los adipocitos diferenciados carentes de esta enzima son más sensibles a altos niveles de ácidos
grasos saturados presentes en los ratones Agpat2-/- después de nacer.
Description
Tesis (Doctor in Biological Sciences, mention in Molecular Genetics and Microbiology)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019