Browsing by Author "Parra, Loreto"

Now showing 1 - 15 of 15
  • Thumbnail Image
    Item
    A Structural View on the Stereospecificity of Plant Borneol-Type Dehydrogenases
    (2021) Chánique Sallusti, Andrea Magdalena; Dimos, Nicole; Drienovská, Ivana; Calderini, Elia; Pantín, Mónica P.; Helmer, Carl P. O.; Hofer, Michael; Sieber, Volker; Parra, Loreto; Loll, Bernhard; Kourist, Robert
    The development of sustainable processes for the valorization of byproducts and other waste streams remains an ongoing challenge in the field of catalysis. Racemic borneol, isoborneol and camphor are currently produced from α-pinene, a side product from the production of cellulose. The pure enantiomers of these monoterpenoids have numerous applications in cosmetics and act as reagents for asymmetric synthesis, making an enzymatic route for their separation into optically pure enantiomers a desirable goal. Known short-chain borneol-type dehydrogenases (BDHs) from plants and bacteria lack the required specificity, stability or activity for industrial utilization. Prompted by reports on the presence of pure (−)-borneol and (−)-camphor in essential oils from rosemary, we set out to investigate dehydrogenases from the genus Salvia and discovered a dehydrogenase with high specificity (E>120) and high specific activity (>0.02 U mg−1) for borneol and isoborneol. Compared to other specific dehydrogenases, the one reported here shows remarkably higher stability, which was exploited to obtain the first three-dimensional structure of an enantiospecific borneol-type short-chain dehydrogenase. This, together with docking studies, led to the identification of a hydrophobic pocket in the enzyme that plays a crucial role in the stereo discrimination of bornane-type monoterpenoids. The kinetic resolution of borneol and isoborneol can be easily integrated into the existing synthetic route from α-pinene to camphor thereby allowing the facile synthesis of optically pure monoterpenols from an abundant renewable source.
  • Thumbnail Image
    Item
    Active Site Flexibility as a Hallmark for Efficient PET Degradation by I-sakaiensis petase
    (2018) Fecker, Tobias; Galaz Davison, Pablo; Engelberger, Felipe; Narui, Yoshie; Sotomayor, Marcos; Parra, Loreto; Ramirez-Sarmiento, Cesar A.
  • Thumbnail Image
    Item
    Aumento de la termoestabilidad de una xilanasa activa en frío mediante ingeniería de proteínas.
    (2020) Pinuer Pinuer, Luis Andrés; Parra, Loreto; Asenjo, Juan A.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    Las enzimas son biocatalizadores biodegradables, no tóxicos, eficientes y selectivos, lo que le permite posicionarse como una alternativa más ecológica y sustentable a la catálisis química tradicional. Existe un grupo de enzimas denominadas enzimas activas a bajas temperaturas, las cuales son particularmente atractivas industrialmente, dado que pueden disminuir los requerimientos energéticos en los procesos industriales, reducir los riesgos de contaminación y la generación de reacciones químicas indeseables que ocurren a temperaturas más elevadas. No obstante, este tipo de enzimas generalmente presentan una baja termoestabilidad, reduciendo sus posibles usos a nivel industrial. Esto ha motivado el desarrollo de diversas técnicas de ingeniería de proteínas con el fin de estabilizar su estructura proteica. Un grupo particular de enzimas que son ampliamente utilizadas en la industria corresponden a las xilanasas, las cuales catalizan la hidrólisis de xilano, uno de los componentes principales de las paredes celulares de las plantas y, por lo tanto, poseen aplicaciones en diferentes sectores incluyendo la alimentación animal y la producción de azúcares bioactivos conocidos como xilo-oligosacáridos (XOS). El objetivo de este estudio fue aumentar la termoestabilidad de la xilanasa XyL-L, aislada desde la bacteria antártica Psychrobacter sp, mediante el uso de técnicas de ingeniería de proteínas sin sacrificar su actividad a bajas temperaturas. Primero se implementaron distintas estrategias para aumentar los niveles de expresión de XyL-L, dado a su escasa producción en los sistemas convencionales. La combinación de estrategias permitió obtener niveles de expresión adecuados para la posterior caracterización enzimática de XyL-L y las variantes generadas. Se utilizaron 2 estrategias de ingeniería de proteínas en búsqueda de mejorar la termoestabilidad de XyL-L, las cuales corresponden a la ingeniería de dominios y la ingeniería de loops. Para la ingeniería de dominios se diseñaron 3 variantes de XyL-L truncadas de sus dominios accesorios, denominados módulos de unión a carbohidratos o CBM. Dos de éstas variantes presentaron mayor termoestabilidad, la variante ΔCBM4, a la que se le ha delecionado el dominio CBM4 y su linker (L1), y la variante ΔCBM22 a la que se le quitó el dominio CBM22 y su linker (L2). No obstante, la variante ΔCBM22 mostró la mayor mejora en la termoestabilidad, con un aumento de 10 veces en la vida media a 40°C. Los parámetros termodinámicos indicaron que la mayor fuerza que condujo a la estabilización de ΔCBM22 fue una reducción de 7 veces en la diferencia entrópica (ΔS#IN). Los resultados de análisis de secuencia revelaron una alta proporción de residuos promotores del desorden en el linker L2. Además, se predijo una región intrínsecamente desordenada (IDR) que abarca el linker L2 y los primeros residuos del dominio CBM22. A raíz de estos hallazgos se analizaron otras enzimas multi-dominios a las cuales se les cortó al menos un dominio CBM, encontrándose que en aquellas enzimas que presentaron una región IDR en el linker o en el dominio cortado evidenciaron un aumento de termoestabilidad luego de la deleción. A raíz de estos resultados se postula que la presencia o ausencia de regiones IDR puede explicar el efecto variable observado luego de la deleción de un dominio accesorio. También es posible concluir que en el caso específico de XyL-L, fue posible obtener una variante con una mejora significativa en la termoestabilidad, la cual corresponde a la variante ΔCBM22. En tanto, en la ingeniería de loops se buscó rigidizar 2 loops del dominio catalítico mediante el acortamiento secuencial de las regiones más expuestas al solvente. Se generaron 3 variantes por cada loop con una deleción de 3, 5 y 7 residuos, no obstante, todas las variantes generadas presentaron una menor termoestabilidad que XyL-L. Se concluye, que la estrategia de ingeniería de loops no fue efectiva en la búsqueda de mejorar la termoestabilidad de XyL-L, lo cual puede deberse a un limitado conocimiento de la estructura del dominio catalítico que pudo haber influido en la selección de los sitios a cortar. El siguiente paso fue evaluar los efectos en la actividad en la variante que presentó la mayor termoestabilidad (ΔCBM22). Los resultados indicaron que ΔCBM22 no presentó cambios en la temperatura óptima (35°C) y mantuvo su actividad a bajas temperaturas, además ΔCBM22 mostró mejoras en la eficiencia catalítica. A raíz de estos resultados se concluye que la variante ΔCBM22, junto con generar una mejora en la termoestabilidad también generó una mejora en la eficiencia catalítica sobre sustratos solubles, manteniendo su actividad a bajas temperaturas. El último paso fue comparar el perfil de XOS producidos por XyL-L con las variantes de dominio, encontrándose diferencias en los XOS producidos a partir de xilano soluble. Los resultados sugieren que la presencia de los dominios CBMs favorecen la actividad sobre XOS de bajo tamaño molecular en XyL-L y que la diferencia del perfil de XOS generados entre las variantes están relacionados a las distintas afinidades por estos XOS. Además, fue posible evidenciar actividad transglicosilasa en XyL-L y las variantes de dominio. De acuerdo a los resultados obtenidos concluimos que fue posible obtener variantes de XyL-L con termoestabilidad mejorada, mediante el uso herramientas de la ingeniería de proteínas sin afectar su eficiencia catalítica y manteniendo su actividad a bajas temperaturas. Se proyecta en el futuro generar nuevas variantes a partir de la información obtenida de la ingeniería de dominios y obtener información estructural que permita realizar técnicas de diseño racional.
  • Thumbnail Image
    Item
    Directed Evolution by Using Iterative Saturation Mutagenesis Based on Multiresidue Sites
    (2013) Parra, Loreto; Agudo, Rubén; Reetz, Manfred T.
  • Thumbnail Image
    Item
  • No Thumbnail Available
    Item
    Discovery of New Phenylacetone Monooxygenase Variants for the Development of Substituted Indigoids through Biocatalysis
    (2022) Núñez Navarro, Nicolás Ernesto; Salazar Muñoz, Javier Alonso; Castillo Suzarte, Francisco Javier; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Poblete Castro, Ignacio; Zacconi, Flavia C. M.; Parra, Loreto
    Indigoids are natural pigments obtained from plants by ancient cultures. Romans used them mainly as dyes, whereas Asian cultures applied these compounds as treatment agents for several diseases. In the modern era, the chemical industry has made it possible to identify and develop synthetic routes to obtain them from petroleum derivatives. However, these processes require high temperatures and pressures and large amounts of solvents, acids, and alkali agents. Thus, enzyme engineering and the development of bacteria as whole-cell biocatalysts emerges as a promising green alternative to avoid the use of these hazardous materials and consequently prevent toxic waste generation. In this research, we obtained two novel variants of phenylacetone monooxygenase (PAMO) by iterative saturation mutagenesis. Heterologous expression of these two enzymes, called PAMOHPCD and PAMOHPED, in E. coli was serendipitously found to produce indigoids. These interesting results encourage us to characterize the thermal stability and enzyme kinetics of these new variants and to evaluate indigo and indirubin production in a whole-cell system by HPLC. The highest yields were obtained with PAMOHPCD supplemented with L-tryptophan, producing ~3000 mg/L indigo and ~130.0 mg/L indirubin. Additionally, both enzymes could oxidize and produce several indigo derivatives from substituted indoles, with PAMOHPCD being able to produce the well-known Tyrian purple. Our results indicate that the PAMO variants described herein have potential application in the textile, pharmaceutics, and semiconductors industries, prompting the use of environmentally friendly strategies to obtain a diverse variety of indigoids.
  • No Thumbnail Available
    Item
    Discovery, Molecular Mechanisms, and Industrial Applications of Cold-Active Enzymes
    (2016) Santiago, M.; Ramírez Sarmiento, Cesar Antonio; Zamora Jofré, Renato Andrés; Parra, Loreto
  • Thumbnail Image
    Item
    Identification and characterization of flavoprotein monooxygenases for biocatalysis
    (2021) Gran Scheuch, Alejandro A.; Parra, Loreto; Fraaije, Marco Wilhelmus; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    En los últimos años se han desarrollado una variedad de enzimas para una gran cantidad de aplicaciones biotecnológicas, haciendo que hoy en día, la biocatálisis tenga un papel fundamental en la sociedad. Los nuevos avances en biocatálisis tienen como objetivo reducir el impacto ambiental de los procesos químicos. En este contexto, ya hace mucho tiempo que la biocatálisis abandonó la mera curiosidad academica; hoy en día se ha convertido en un campo maduro y ampliamente explotado, como por ejemplo, por las industrias química y farmacéutica. Esto ocurrió porque los biocatalizadores (enzimas) permiten un control estricto sobre la selectividad de sus reacciones, esto hace a las enzimas alternativas exquisitas para catálisis química. Por otro lado, también contribuyen al desarrollo de una industria más ecológica y a destapar nueva química que está aún sin explotar. Las flavoenzimas son un excelente ejemplo de biocatalizadores biotecnológicamente interesantes. Estas enzimas son máquinas biomoleculares altamente versátiles que realizan una amplia gama de reacciones y representan una gran cantidad de los biocatalizadores que actualmente se encuentran disponibles para la química RedOx. La flavoenzimología es un campo multidisciplinario, cuyo objetivo es aumentar la comprensión general de estas enzimas que contienen flavina como cofactor. Esto último, bajo un profundo enfoque en el estudio de los mecanismos catalíticos, propiedades cinéticas y relaciones de secuenciaestructura- función. Una mejor comprensión de estas enzimas ha permitido el desarrollo de biocatalizadores mejorados. En el Capítulo 1, las ventajas de la biocatálisis para las reacciones de oxidación de tipo Baeyer-Villiger son bien ejemplificadas. Aunque el método químico para tales oxidaciones ofrece una ruta sintética simple para oxidar cetonas en ésteres o lactonas, requiere el uso de reactivos peligrosos. Además, son típicamente no quimio-, regio- o enantioselectivos. Como alternativa atractiva, las monooxigenasas de tipo Baeyer-Villiger (BVMOs) que contienen flavina como grupo prostético, se han investigado durante mucho tiempo por su alto potencial biocatalítico[1-5]. En las últimas décadas se han descubierto o diseñado varias BVMOs que exhiben actividades adecuadas para la síntesis de compuestos valiosos. En el capítulo 1, resumimos el estado del arte del uso de estas enzimas como biocatalizadores, nos centramos así en sus propiedades bioquímicas, mecanísticas y estructurales. Aunque pareciera ser un campo relativamente maduro, todavía existen desafíos que los flavoenzimólogos deben desentrañar. Limitaciones como estabilidad moderada, baja especificidad y la dependencia de cofactores, a menudo disminuyen las opciones de ser usadas a nivel industrial. De todos modos, actualmente, se está avanzando en la superación de todas estas limitaciones. Muchas (flavo)enzimas dependen de cofactores disociables para la catálisis, como el NAD(P) H. Los costos relacionados con tal dependencia de cofactores pueden superarse en parte, mediante el uso de enzimas bifuncionales autosuficientes que regeneran el cofactor de manera eficiente. En el capítulo 2, diseñamos un protocolo experimental para evaluar el efecto de la longitud de un linker flexible rico en glicinas sobre las propiedades de fusiones de TbADH y TmCHMO. Este protocolo experimental permite la generación de biocatalizadores optimizados. Además, el procedimiento se puede modificar fácilmente para generar una biblioteca similar de otras proteínas de fusión. Como reacción de demostración, las enzimas de fusión ADH-BVMO generadas, se analizaron para la síntesis de ε-caprolactona, un precursor de polímero valioso, usando ciclohexanol como sustrato inicial de la cascada. Tal reacción aprovecha el hecho de que ambas actividades enzimáticas satisfacen su dependencia de cofactor: la actividad ADH convierte NADP+ en NADPH, mientras que, a su vez, la actividad BVMO oxida NADPH en NADP+. Además, los biocatalizadores bifuncionales fusionados pueden mejorar la estabilidad de la proteína y promover la canalización de intermediarios del producto por efectos de proximidad. Vale la pena mencionar, que no existen reglas uniformes para diseñar linkers óptimos para proteínas de fusión. Sin embargo, un enlazador “incorrecto” puede provocar efectos perjudiciales sobre el rendimiento biocatalítico[6]. El trabajo presentado se enfocó en la evaluación del efecto de quince variantes de linker de diferente largo sobre la: expresión, termoestabilidad, actividad y niveles de conversión. Todas las variantes obtenidas exhibieron altos niveles de expresión (250-360 mg L-1) y se obtuvieron principalmente como holoproteínas (según la razón A280:A440). Tanto para TmCHMO como para TbADH, se observó que la longitud del linker no mostró un efecto perjudicial significativo sobre su termoestabilidad. En cuanto a la actividad, las actividades de oxidación del alcohol (ADH) y sulfoxidación (BVMO) fueron similares para las 9 variantes más cortas, mientras que las fusiones con la longitud del conector de 10, 12 y 15 aminoácidos mostraron una actividad ligeramente aumentada. Las bioconversiones a pequeña escala dieron como resultado turnover numbers (TON) más altos para las fusiones con linker de 2, 3, 6, 7, 13 y 14 aminoácidos (TON de 20.000-25.000). El TON de la reacción control catalizada por las enzimas no fusionadas fue de alrededor de 12.000. En el capítulo 3, estudiamos la reactividad de flavoenzimas con dioxígeno, un tema fascinante para la flavoenzimólogia. El dioxígeno es un oxidante de cuatro electrones que puede activarse enzimáticamente y reducirse a peróxido de hidrógeno o agua mediante transferencias consecutivas de un electrón. En algunos casos, se pueden formar otras especies reactivas de oxígeno (ROS), como el superóxido. En el capítulo 3, investigamos la formación de ROS —o desacoplamiento— durante la reducción de dioxígeno mediada por el cofactor de flavoproteínas (oxidasas y monooxigenasas), utilizando PAMOWT, PAMOC65D, EUGO y HMFO como enzimas a analizar. El análisis del desacoplamiento en flavoproteínas es de gran relevancia porque el ROS tienen un papel relevante en biología (transduccion de señales), por otro lado, puede complicar el uso de flavoenzimas como biocatalizadores. Además, el mecanismo de formación de ROS mediada por flavoenzimas aún no se comprende completamente. Para este capítulo, se determinaron perfiles precisos de producción de peróxido de hidrógeno y superóxido en diferentes condiciones operativas para todas las flavoenzimas estudiadas. Sorprendentemente, se descubrió que todas las proteínas producen cantidades significativas de superóxido. Además, se detectaron mayores de esta molécula a pH más altos, esto sugiere una disociación de los pares de radicales sensible al pH. A pesar de la acumulación de superóxido, no se demostró ningún efecto perjudicial de este sobre la biocatálisis. Curiosamente, para PAMOWT y EUGO, la adición de catalasa aumentó significativamente el rendimiento catalítico. Los resultados proporcionan una mejor visión de las condiciones que promueven la formación de ROS en flavoenzimas y podría ayudar a reducir la formación de estas especies a nivel industrial, evitando el desperdicio de valiosos equivalentes reductores. La segunda parte de esta tesis trata de la identificación y caracterización de varias monooxigenasas que contienen flavina. Estudios sobre nuevas flavoenzimas proporcionan más información sobre la química con enzimas naturales y también pueden conducir a nuevas aplicaciones biocatalíticas. En el capítulo 4, en colaboración con el Instituto de Microbiología del ETH (Zürich, Suiza), se estudió la participación de BVMO en la producción de algunos policétidos específicos. Se demostró que BVMO de origen bacteriano eran capaz de insertar un atomo de oxígeno a través de una oxidación de Baeyer- Villiger en esqueletos de policétido naciente. Se establecieron las propiedades bioquímicas de dos BVMOs: Oock y LmbC-Ox. Finalmente, se demostró que estas flavoenzimas están involucradas en la biosíntesis de los metabolitos secundarios oocidina y lobatamida. El Capítulo 5 describe los esfuerzos para encontrar prometedoras flavin-containing monooxigenases (FMOs) de tipo I o tipo II. Mediante minería genómica, identificamos dos proteínas: una de origen bacteriano (Chloroflexi) y otra proveniente del tardígrado Hypsibius dujardini: CbFMO (FMO de tipo II) y HdFMO (FMO de tipo I), respectivamente. Ambas enzimas mostraron características bioquímicas distintas. HdFMO mostró solo actividad con sulfuros, y solo aceptó NADPH como donante de hidruro, además de presentar una termoestabilidad moderada (TM app de 45 ° C). Por el contrario, CbFMO convirtió preferentemente cetonas en los respectivos ésteres o lactonas y mostró una baja termoestabilidad (TM app de 34 ° C). La motivación para estudiar CbFMO, un FMO de tipo II, se debió en parte, a que este grupo de enzimas han sido descritas con una promiscua especificidad por el cofactor de nicotinamida[7]. Sin embargo, se encontró que CbFMO tiene una fuerte preferencia por NADPH. Por lo tanto, en comparación con la colección ya descrita de monooxigenasas de flavoproteínas, ambas FMO no parecieron muy atractivas para procesos biocatáliticos. Finalmente, en el capítulo 6, se identificaron dos BVMO de tipo I de Streptomyces leeuwenhoekii C34: Sle_13190 y Sle_62070. Ambas enzimas se expresaron con éxito, fusionadas con un regenerador de cofactor (fosfito deshidrogenasa). Al igual que otros BVMO de tipo I, ambas proteínas mostraron oxidación de Baeyer-Villiger dependiente de NADPH. Las secuencias de Sle_13190 y Sle_62070 se asociaron basándose en la homología de secuencia, con otras BVMOs descritas que actúan sobre compuestos voluminosos. En este contexto, no fue sorprendente que aceptaran como sustrato compuestos bastante complejos, incluidos bifenilos y un esteroide. Además, se encontró que ambas enzimas eran moderadamente robustas, exhibiendo una TM app de 45 ° C y tolerancia a cosolventes miscibles en agua. En particular, se encontró que Sle_62070 es altamente activo con cetonas cíclicas y mostró una alta regioselectividad produciendo solo la lactona de 2-fenilciclohexanona, y una alta enantioselectividad para la conversion de biciclo[3.2.0]hept-2- en-6-ona produciendo solo las lactonas (-)-1S, 5R normal y (-)-1R, 5S abnormal (e.e. > 99 %). Estas dos BVMOs recién descubiertas pueden convertirse en valiosas adiciones a la colección de BVMOs. El trabajo descrito en esta tesis proporcionó varias enzimas nuevas, que pueden emplearse como biocatalizadores, además de nuevos conocimientos sobre sus propiedades catalíticas. El trabajo recalca que los ambientes extremos pueden ser una gran fuente de enzimas robustas sin explotar, como se demostró con las dos BVMOs identificadas en una bacteria aislada del desierto de Atacama (capítulo 6). Además, se obtuvo y estudió una flavoenzima de un tardígrado, un animal microscópico que se puede criopreservarse, el cual no se había considerado antes como fuente de biocatalizadores. Desafortunadamente, esta busqueda no condujo a la obtencion de un catalizador muy prometedor. Muestra de que los organismos que pueden sobrevivir en condiciones extremas no siempre (solo) albergan biocatalizadores robustos. Además de explorar las secuencias de genomas de microorganismos (termófilos), el empleo de un enfoque metagenómico también puede ser de alta útilidad para la busqueda de enzimas con enfoque industrial. Los enfoques metagenómicos actuales permiten el manejo de fuentes ricas en materia biosintetica oscura, lo que puede conducir a descubir nueva (bio)química[8,9]. En este sentido, el esfuerzo combinado en el descubrimiento de nuevas enzimas, estudios de mecanismos y la ingeniería de enzimas hará que las reacciones biocatalíticas sean aún más eficientes, fiables y amigables con el medio ambiente. Esto permitirá que la biocatálisis sea un competidor sustentable a las rutas químicas clásicas, permitiendo nuevas aplicaciones basadas en enzimas a nivel industrial.
  • Thumbnail Image
    Item
    Identification of lipase encoding genes from Antarctic seawater bacteria using degenerate primers : Expression of a cold-active lipase with high specific activity
    (2015) Parra, Loreto; Espina, Giannina; Devia, Javier; Salazar, Oriana; Andrews, Barbara; Asenjo, Juan A.
  • Thumbnail Image
    Item
    Ingeniería racional de la enzima resveratrol O-metiltransferasa para la síntesis biológica de pinoestilbeno
    (2022) Herrera Toro, Daniela Paula; Parra, Loreto; Schüller, Andreas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    Los estilbenos son compuestos fenólicos derivados del metabolismo secundario de las plantas y cumplen un rol fundamental en su respuesta defensiva. El resveratrol es uno de los estilbenos más estudiados debido a sus propiedades benéficas para la salud humana. Sin embargo, al ser consumido, es metabolizado rápidamente mostrando una baja biodisponibilidad. Se ha reportado que derivados metilados de resveratrol, tienen una mayor estabilidad y biodisponibilidad, y por tanto un mayor valor agregado y atractivo industrial. El avance en la biocatálisis y la ingeniería metabólica ha permitido que la biosíntesis de resveratrol y derivados, mediante microorganismos optimizados, sea una alternativa sustentable a la síntesis química y a su extracción desde fuentes naturales. Existen escasos estudios que aborden la biosíntesis de pinoestilbeno, resveratrol mono-metilado, de elevado valor comercial. Principalmente porque las enzimas caracterizadas con actividad Ometiltransferasa (OMT), presentan una baja eficiencia en catalizar la mono-metilación de resveratrol, favoreciendo la di-metilación de este compuesto en una reacción secuencial de dos pasos, obteniendo pteroestilbeno como principal producto. Para generar una ruta alternativa de biosíntesis de pinoestilbeno, en esta investigación aplicamos una estrategia de ingeniería racional de proteínas en la enzima resveratrol OMT de Vitis vinifera (VvROMT), la que presenta la mayor eficiencia catalítica descrita en di-metilar resveratrol y obtener pteroestilbeno. En ausencia de la estructura cristalográfica de VvROMT, construimos un modelo tridimensional por homología en una conformación cerrada y catalíticamente competente, en complejo con resveratrol y S-adenosil-metionina. Caracterizamos el sitio de unión a sustrato de VvROMT a través de diferentes herramientas in silico, lo que nos permitió identificar cuatro residuos críticos. Construimos las variantes W20A, F24A, F311A, y F318A mediante mutagénesis sitio dirigida y observamos una disminución considerable de su actividad enzimática a partir de resveratrol, validando nuestro modelo estructural. Luego, mediante un diseño racional, aplicando una estrategia basada en estructura y un análisis comparativo de los residuos del sitio activo entre VvROMT y otras estilbeno OMTs, generamos ocho variantes. La variante F311W/L117F generó hasta un 67% de conversión a pinoestilbeno después de 24 h de reacción mientras que con la enzima nativa no se detectó pinoestilbeno y se obtuvo un 44,2% de conversión a pteroestilbeno. Por otro lado, la variante L117F presentó una mejora global en su actividad específica. Logramos modificar exitosamente la preferencia de sustrato de VvROMT, pasando desde una di-metilación secuencial a mono-metilar resveratrol y obtener pinoestilbeno como principal producto. Estas variantes pueden ser incluidas en rutas sintéticas existentes para la biosíntesis sustentable de pinoestilbeno en sistemas recombinantes. Nuestros resultados sugieren que el sitio activo de VvROMT puede ser ingenierizado para diversificar la producción de estilbenos y otros compuestos fenólicos industrialmente competitivos y beneficiosos para la salud y nutrición humana.
  • Thumbnail Image
    Item
    Mining the genome of Streptomyces leeuwenhoekii : Two new Type I baeyer-villiger monooxygenases from Atacama desert
    (2018) Gran Scheuch, Alejandro A.; Trajkovic, M.; Parra, Loreto; Fraaije, M.W.
  • Thumbnail Image
    Item
  • Thumbnail Image
    Item
    Phenotype based discovery of selected oxidoreductases for the utilization of renewable resources
    (2021) Chánique Sallusti, Andrea Magdalena; Parra, Loreto; Kourist, Robert; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    El descubrimiento de nuevos biocatalizadores que se adapten a diversas condiciones de proceso es fundamental para implementar la biocatálisis a nivel industrial. Una técnica valiosa para buscar nuevas enzimas es el descubrimiento basado en el fenotipo, en el que las características que se encuentran en el hábitat de un organismo se utilizan como un indicador de la presencia de enzimas que funcionan en esas condiciones. El mismo razonamiento puede ser utilizado al encontrar un producto de interés en el ambiente: probablemente los organismos que viven allí producen enzimas capaces de sintetizar y degradar estos compuestos. Posteriormente, se pueden aplicar técnicas de ingeniería de proteínas a las nuevas enzimas y mejorar más aún sus características. En este trabajo, se utilizó el descubrimiento basado en fenotipo para identificar nuevas oxidorreductasas con características de relevancia industrial. La investigación se centró en encontrar nuevos miembros de dos familias: monooxigenasas de Bayer-Villiger (BVMO) y borneol deshidrogenasas de cadena corta (BDH). En el caso de BVMO, la búsqueda en el genoma de microorganismos antárticos condujo al descubrimiento de una monooxigenasa activa en frío. La enzima muestra una temperatura óptima de 20°C, presenta un 70% de su actividad óptima a 5°C y tiene una buena tolerancia a solventes orgánicos. La enzima muestra promiscuidad de cofactor y cataliza la monooxigenación de sustratos como norcamphor y biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona de manera regio y enantioselectiva. En el caso de la familia de BDH, se realizó una búsqueda en el genoma de plantas que contienen un alto porcentaje de borneol o alcanfor en sus aceites esenciales, lo que condujo al descubrimiento de enzimas capaces de catalizar la oxidación de borneol de forma enantioespecífica. Algunas de estas enzimas también catalizan la reducción de alcanfor de manera diastereoselectiva. La determinación de las estructuras tridimensionales de dos de estas enzimas permitió estudiar los determinantes estructurales de la especificidad y selectividad. Se utilizó comparación de secuencias, comparación de estructuras, acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida para dilucidar la influencia de los residuos del sitio activo en estas características. También se utilizó reconstrucción de secuencias ancestrales para estudiar la historia evolutiva de esta familia en términos de especificidad y termoestabilidad. Esto llevó a la caracterización de ancestros con una especificidad moderada, en contraste con las enzimas existentes, que presentan una especificidad muy alta (E>200) o baja.
  • Thumbnail Image
    Item
    Relevance of local flexibility near the active site for enzymatic catalysis : biochemical characterization and engineering of cellulase Cel5A from bacillus agaradherans
    (2018) Saavedra, Juan M.; Azócar, Mauricio A.; Rodríguez, Vida; Ramírez Sarmiento, Cesar Antonio; Andrews, Barbara A.; Asenjo, Juan A.; Parra, Loreto
  • Thumbnail Image
    Item
    Surfing the blood coagulation cascade : insight into the Vital Factor Xa
    (2019) Núñez-Navarro, Nicolás E.; Santana Romo, Fabián Mauricio; Parra, Loreto; Zacconi, Flavia C. M.