Identification and characterization of flavoprotein monooxygenases for biocatalysis
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Date
2021
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Abstract
En los últimos años se han desarrollado una variedad de enzimas para una gran cantidad
de aplicaciones biotecnológicas, haciendo que hoy en día, la biocatálisis tenga un papel
fundamental en la sociedad. Los nuevos avances en biocatálisis tienen como objetivo reducir
el impacto ambiental de los procesos químicos. En este contexto, ya hace mucho tiempo
que la biocatálisis abandonó la mera curiosidad academica; hoy en día se ha convertido
en un campo maduro y ampliamente explotado, como por ejemplo, por las industrias
química y farmacéutica. Esto ocurrió porque los biocatalizadores (enzimas) permiten un
control estricto sobre la selectividad de sus reacciones, esto hace a las enzimas alternativas
exquisitas para catálisis química. Por otro lado, también contribuyen al desarrollo de una
industria más ecológica y a destapar nueva química que está aún sin explotar.
Las flavoenzimas son un excelente ejemplo de biocatalizadores biotecnológicamente
interesantes. Estas enzimas son máquinas biomoleculares altamente versátiles que realizan
una amplia gama de reacciones y representan una gran cantidad de los biocatalizadores
que actualmente se encuentran disponibles para la química RedOx. La flavoenzimología
es un campo multidisciplinario, cuyo objetivo es aumentar la comprensión general de estas
enzimas que contienen flavina como cofactor. Esto último, bajo un profundo enfoque en
el estudio de los mecanismos catalíticos, propiedades cinéticas y relaciones de secuenciaestructura-
función. Una mejor comprensión de estas enzimas ha permitido el desarrollo de
biocatalizadores mejorados.
En el Capítulo 1, las ventajas de la biocatálisis para las reacciones de oxidación de tipo
Baeyer-Villiger son bien ejemplificadas. Aunque el método químico para tales oxidaciones
ofrece una ruta sintética simple para oxidar cetonas en ésteres o lactonas, requiere el uso
de reactivos peligrosos. Además, son típicamente no quimio-, regio- o enantioselectivos.
Como alternativa atractiva, las monooxigenasas de tipo Baeyer-Villiger (BVMOs) que
contienen flavina como grupo prostético, se han investigado durante mucho tiempo por su
alto potencial biocatalítico[1-5]. En las últimas décadas se han descubierto o diseñado varias
BVMOs que exhiben actividades adecuadas para la síntesis de compuestos valiosos. En el
capítulo 1, resumimos el estado del arte del uso de estas enzimas como biocatalizadores,
nos centramos así en sus propiedades bioquímicas, mecanísticas y estructurales.
Aunque pareciera ser un campo relativamente maduro, todavía existen desafíos que los
flavoenzimólogos deben desentrañar. Limitaciones como estabilidad moderada, baja
especificidad y la dependencia de cofactores, a menudo disminuyen las opciones de ser
usadas a nivel industrial. De todos modos, actualmente, se está avanzando en la superación
de todas estas limitaciones.
Muchas (flavo)enzimas dependen de cofactores disociables para la catálisis, como el NAD(P)
H. Los costos relacionados con tal dependencia de cofactores pueden superarse en parte,
mediante el uso de enzimas bifuncionales autosuficientes que regeneran el cofactor de
manera eficiente. En el capítulo 2, diseñamos un protocolo experimental para evaluar el
efecto de la longitud de un linker flexible rico en glicinas sobre las propiedades de fusiones de
TbADH y TmCHMO. Este protocolo experimental permite la generación de biocatalizadores
optimizados. Además, el procedimiento se puede modificar fácilmente para generar una
biblioteca similar de otras proteínas de fusión. Como reacción de demostración, las enzimas de
fusión ADH-BVMO generadas, se analizaron para la síntesis de ε-caprolactona, un precursor
de polímero valioso, usando ciclohexanol como sustrato inicial de la cascada. Tal reacción
aprovecha el hecho de que ambas actividades enzimáticas satisfacen su dependencia de
cofactor: la actividad ADH convierte NADP+ en NADPH, mientras que, a su vez, la actividad
BVMO oxida NADPH en NADP+. Además, los biocatalizadores bifuncionales fusionados
pueden mejorar la estabilidad de la proteína y promover la canalización de intermediarios
del producto por efectos de proximidad. Vale la pena mencionar, que no existen reglas
uniformes para diseñar linkers óptimos para proteínas de fusión. Sin embargo, un enlazador
“incorrecto” puede provocar efectos perjudiciales sobre el rendimiento biocatalítico[6]. El
trabajo presentado se enfocó en la evaluación del efecto de quince variantes de linker de
diferente largo sobre la: expresión, termoestabilidad, actividad y niveles de conversión. Todas
las variantes obtenidas exhibieron altos niveles de expresión (250-360 mg L-1) y se obtuvieron
principalmente como holoproteínas (según la razón A280:A440). Tanto para TmCHMO
como para TbADH, se observó que la longitud del linker no mostró un efecto perjudicial
significativo sobre su termoestabilidad. En cuanto a la actividad, las actividades de oxidación
del alcohol (ADH) y sulfoxidación (BVMO) fueron similares para las 9 variantes más cortas,
mientras que las fusiones con la longitud del conector de 10, 12 y 15 aminoácidos mostraron
una actividad ligeramente aumentada. Las bioconversiones a pequeña escala dieron como
resultado turnover numbers (TON) más altos para las fusiones con linker de 2, 3, 6, 7, 13 y
14 aminoácidos (TON de 20.000-25.000). El TON de la reacción control catalizada por las
enzimas no fusionadas fue de alrededor de 12.000.
En el capítulo 3, estudiamos la reactividad de flavoenzimas con dioxígeno, un tema
fascinante para la flavoenzimólogia. El dioxígeno es un oxidante de cuatro electrones que
puede activarse enzimáticamente y reducirse a peróxido de hidrógeno o agua mediante
transferencias consecutivas de un electrón. En algunos casos, se pueden formar otras
especies reactivas de oxígeno (ROS), como el superóxido. En el capítulo 3, investigamos
la formación de ROS —o desacoplamiento— durante la reducción de dioxígeno mediada
por el cofactor de flavoproteínas (oxidasas y monooxigenasas), utilizando PAMOWT,
PAMOC65D, EUGO y HMFO como enzimas a analizar. El análisis del desacoplamiento en
flavoproteínas es de gran relevancia porque el ROS tienen un papel relevante en biología
(transduccion de señales), por otro lado, puede complicar el uso de flavoenzimas como biocatalizadores. Además, el mecanismo de formación de ROS mediada por flavoenzimas
aún no se comprende completamente.
Para este capítulo, se determinaron perfiles precisos de producción de peróxido de
hidrógeno y superóxido en diferentes condiciones operativas para todas las flavoenzimas
estudiadas. Sorprendentemente, se descubrió que todas las proteínas producen cantidades
significativas de superóxido. Además, se detectaron mayores de esta molécula a pH más
altos, esto sugiere una disociación de los pares de radicales sensible al pH. A pesar de
la acumulación de superóxido, no se demostró ningún efecto perjudicial de este sobre
la biocatálisis. Curiosamente, para PAMOWT y EUGO, la adición de catalasa aumentó
significativamente el rendimiento catalítico. Los resultados proporcionan una mejor visión
de las condiciones que promueven la formación de ROS en flavoenzimas y podría ayudar a
reducir la formación de estas especies a nivel industrial, evitando el desperdicio de valiosos
equivalentes reductores.
La segunda parte de esta tesis trata de la identificación y caracterización de varias
monooxigenasas que contienen flavina. Estudios sobre nuevas flavoenzimas proporcionan
más información sobre la química con enzimas naturales y también pueden conducir a
nuevas aplicaciones biocatalíticas. En el capítulo 4, en colaboración con el Instituto
de Microbiología del ETH (Zürich, Suiza), se estudió la participación de BVMO en
la producción de algunos policétidos específicos. Se demostró que BVMO de origen
bacteriano eran capaz de insertar un atomo de oxígeno a través de una oxidación de Baeyer-
Villiger en esqueletos de policétido naciente. Se establecieron las propiedades bioquímicas
de dos BVMOs: Oock y LmbC-Ox. Finalmente, se demostró que estas flavoenzimas están
involucradas en la biosíntesis de los metabolitos secundarios oocidina y lobatamida.
El Capítulo 5 describe los esfuerzos para encontrar prometedoras flavin-containing
monooxigenases (FMOs) de tipo I o tipo II. Mediante minería genómica, identificamos
dos proteínas: una de origen bacteriano (Chloroflexi) y otra proveniente del tardígrado
Hypsibius dujardini: CbFMO (FMO de tipo II) y HdFMO (FMO de tipo I), respectivamente.
Ambas enzimas mostraron características bioquímicas distintas. HdFMO mostró solo
actividad con sulfuros, y solo aceptó NADPH como donante de hidruro, además de
presentar una termoestabilidad moderada (TM
app de 45 ° C). Por el contrario, CbFMO
convirtió preferentemente cetonas en los respectivos ésteres o lactonas y mostró una baja
termoestabilidad (TM
app de 34 ° C). La motivación para estudiar CbFMO, un FMO de tipo
II, se debió en parte, a que este grupo de enzimas han sido descritas con una promiscua
especificidad por el cofactor de nicotinamida[7]. Sin embargo, se encontró que CbFMO
tiene una fuerte preferencia por NADPH. Por lo tanto, en comparación con la colección ya
descrita de monooxigenasas de flavoproteínas, ambas FMO no parecieron muy atractivas
para procesos biocatáliticos.
Finalmente, en el capítulo 6, se identificaron dos BVMO de tipo I de Streptomyces
leeuwenhoekii C34: Sle_13190 y Sle_62070. Ambas enzimas se expresaron con éxito,
fusionadas con un regenerador de cofactor (fosfito deshidrogenasa). Al igual que otros
BVMO de tipo I, ambas proteínas mostraron oxidación de Baeyer-Villiger dependiente de
NADPH. Las secuencias de Sle_13190 y Sle_62070 se asociaron basándose en la homología
de secuencia, con otras BVMOs descritas que actúan sobre compuestos voluminosos. En
este contexto, no fue sorprendente que aceptaran como sustrato compuestos bastante
complejos, incluidos bifenilos y un esteroide. Además, se encontró que ambas enzimas
eran moderadamente robustas, exhibiendo una TM
app de 45 ° C y tolerancia a cosolventes
miscibles en agua. En particular, se encontró que Sle_62070 es altamente activo con
cetonas cíclicas y mostró una alta regioselectividad produciendo solo la lactona de 2-fenilciclohexanona,
y una alta enantioselectividad para la conversion de biciclo[3.2.0]hept-2-
en-6-ona produciendo solo las lactonas (-)-1S, 5R normal y (-)-1R, 5S abnormal (e.e. > 99
%). Estas dos BVMOs recién descubiertas pueden convertirse en valiosas adiciones a la
colección de BVMOs.
El trabajo descrito en esta tesis proporcionó varias enzimas nuevas, que pueden emplearse
como biocatalizadores, además de nuevos conocimientos sobre sus propiedades catalíticas.
El trabajo recalca que los ambientes extremos pueden ser una gran fuente de enzimas
robustas sin explotar, como se demostró con las dos BVMOs identificadas en una bacteria
aislada del desierto de Atacama (capítulo 6). Además, se obtuvo y estudió una flavoenzima
de un tardígrado, un animal microscópico que se puede criopreservarse, el cual no se había
considerado antes como fuente de biocatalizadores. Desafortunadamente, esta busqueda no
condujo a la obtencion de un catalizador muy prometedor. Muestra de que los organismos
que pueden sobrevivir en condiciones extremas no siempre (solo) albergan biocatalizadores
robustos. Además de explorar las secuencias de genomas de microorganismos (termófilos),
el empleo de un enfoque metagenómico también puede ser de alta útilidad para la busqueda
de enzimas con enfoque industrial. Los enfoques metagenómicos actuales permiten el
manejo de fuentes ricas en materia biosintetica oscura, lo que puede conducir a descubir
nueva (bio)química[8,9]. En este sentido, el esfuerzo combinado en el descubrimiento de
nuevas enzimas, estudios de mecanismos y la ingeniería de enzimas hará que las reacciones
biocatalíticas sean aún más eficientes, fiables y amigables con el medio ambiente. Esto
permitirá que la biocatálisis sea un competidor sustentable a las rutas químicas clásicas,
permitiendo nuevas aplicaciones basadas en enzimas a nivel industrial.
Description
Tesis (Doctor in Engineering Sciences)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2021
Tesis (Ph.D.)--University of Groningen, 2021
Tesis (Ph.D.)--University of Groningen, 2021