Ingeniería racional de la enzima resveratrol O-metiltransferasa para la síntesis biológica de pinoestilbeno
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Date
2022
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Abstract
Los estilbenos son compuestos fenólicos derivados del metabolismo secundario de las plantas y cumplen un rol fundamental en su respuesta defensiva. El resveratrol es uno de los estilbenos más estudiados debido a sus propiedades benéficas para la salud humana. Sin embargo, al ser consumido, es metabolizado rápidamente mostrando una baja biodisponibilidad. Se ha reportado que derivados metilados de resveratrol, tienen una mayor estabilidad y biodisponibilidad, y por tanto un mayor valor agregado y atractivo industrial. El avance en la biocatálisis y la ingeniería metabólica ha permitido que la biosíntesis de resveratrol y derivados, mediante microorganismos optimizados, sea una alternativa sustentable a la síntesis química y a su extracción desde fuentes naturales. Existen escasos estudios que aborden la biosíntesis de pinoestilbeno, resveratrol mono-metilado, de elevado valor comercial. Principalmente porque las enzimas caracterizadas con actividad Ometiltransferasa (OMT), presentan una baja eficiencia en catalizar la mono-metilación de resveratrol, favoreciendo la di-metilación de este compuesto en una reacción secuencial de dos pasos, obteniendo pteroestilbeno como principal producto. Para generar una ruta alternativa de biosíntesis de pinoestilbeno, en esta investigación aplicamos una estrategia de ingeniería racional de proteínas en la enzima resveratrol OMT de Vitis vinifera (VvROMT), la que presenta la mayor eficiencia catalítica descrita en di-metilar resveratrol y obtener
pteroestilbeno. En ausencia de la estructura cristalográfica de VvROMT, construimos un modelo tridimensional por homología en una conformación cerrada y catalíticamente competente, en complejo con resveratrol y S-adenosil-metionina. Caracterizamos el sitio de unión a sustrato de VvROMT a través de diferentes herramientas in silico, lo que nos permitió identificar cuatro residuos críticos. Construimos las variantes W20A, F24A, F311A, y F318A mediante mutagénesis sitio dirigida y observamos una disminución considerable de su actividad enzimática a partir de resveratrol, validando nuestro modelo estructural. Luego, mediante un diseño racional, aplicando una estrategia basada en estructura y un análisis comparativo de los residuos del sitio activo entre VvROMT y otras estilbeno OMTs, generamos ocho variantes. La variante F311W/L117F generó hasta un 67% de conversión a pinoestilbeno después de 24 h de reacción mientras que con la enzima nativa no se detectó pinoestilbeno y se obtuvo un 44,2% de conversión a pteroestilbeno. Por otro lado, la variante L117F presentó una mejora global en su actividad específica. Logramos modificar exitosamente la preferencia de sustrato de VvROMT, pasando desde una di-metilación secuencial a mono-metilar resveratrol y obtener pinoestilbeno como principal producto. Estas variantes pueden ser incluidas en rutas sintéticas existentes para la biosíntesis sustentable de pinoestilbeno en sistemas recombinantes. Nuestros resultados sugieren que el sitio activo de VvROMT puede ser ingenierizado para diversificar la producción de estilbenos y otros
compuestos fenólicos industrialmente competitivos y beneficiosos para la salud y nutrición humana.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias de la Ingeniería)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2022
Keywords
Estilbenos, Ingeniería racional de enzimas, Modelamiento por homología, O-metiltransferasas, Pinoestilbeno, Resveratrol