3.06 Tesis doctorado
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Browsing 3.06 Tesis doctorado by Author "Andrés Coke, María Estela"
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- ItemRole of cerebral dopamine neurotrophic factor in endoplasmic reticulum stress.(2019) Arancibia Radich, Duxan Andrés; Andrés Coke, María Estela; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasEl factor neurotrófico cerebral dopaminérgico (CDNF) es un péptido de 187 aminoácidos localizado en el retículo endoplasmático de numerosos tipos celulares y conservado evolutivamente. CDNF ejerce un efecto protector sobre las neuronas en modelos celulares y animales de diversas enfermedades neurodegenerativas, pero se desconoce el mecanismo molecular de este efecto. Muchas enfermedades neurodegenerativas se han relacionado con una desregulación de la proteostasis en el retículo endoplásmico. La desregulación de la proteostasis produce estrés reticular lo que gatilla inicialmente la respuesta adaptativa a proteínas mal plegadas y, si el estrés persiste en el tiempo, se inducen vías de señalización relacionadas a la muerte celular o apoptosis. Varios estudios han revelado que una respuesta adaptativa resuelve el estrés de retículo endoplasmático atenuando la síntesis de proteínas, induciendo la expresión de chaperonas y metabolizando las proteínas mal plegadas. En esta tesis, investigamos si CDNF regula la proteostasis del retículo endoplásmico. Con este fin, se determinó la función de CDNF en un modelo de estrés de retículo endoplásmico inducido por Tapsigargina, en células HEK293-T y neuronas hipocampales en cultivo. Se observó que la expresión de CDNF aumentó significativamente la viabilidad de células HEK293-T expuestas a Tapsigargina. Este efecto, correlacionó con aumento de los niveles de proteínas protectoras de la respuesta a proteína mal plegada temprana tales como BiP, ATF4, ATF6 y XBP-1, tanto en las células HEK293-T como en neuronas. Además, la expresión de CDNF redujo los niveles de las proteínas pro-apoptóticas CHOP y caspasa-3 activa. Se determinó que CDNF protege a las células desde el retículo endoplásmico, dado que una versión mutante de CDNF carente de la secuencia de retención en retículo endoplásmico, y por lo tanto secretada, no protegió a las células frente al estrés inducido por Tapsigargina. En conclusión, CDNF regula la proteostasis en retículo endoplásmico induciendo la respuesta a proteína mal plegada adaptativa e inhibiendo las vías pro-apoptóticas activadas por el estrés de retículo endoplásmico. Finalmente, en la última parte de esta tesis se diseñó y construyó un dispositivo molecular de expresión regulada de CDNF, que combina métodos optogenéticos con una plataforma lentiviral.
- ItemuLSD1/neuroLSD1 ratio is a molecular sensor of dopaminergic transmission and a regulator of the immediate-early gene Nur77(2020) Olivares Costa, Montserrat; Andrés Coke, María Estela; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLos genes tempranos inmediatos (IEG, por sus siglas en inglés) son rápida y transitoriamente inducidos luego de la estimulación neuronal y su función está estrechamente relacionada con plasticidad sináptica y regulación de la expresión génica. El IEG, NR4A1 (Nur77) es un factor de transcripción altamente modulado por la transmisión dopaminérgica y se ha relacionado a enfermedades que se caracterizan por alteraciones en el sistema dopaminérgico como estrés, ansiedad, adicción y esquizofrenia. Sin embargo, los mecanismos que regulan su expresión, así como su función específica en las neuronas, no están del todo comprendidos. Nosotros proponemos a la enzima epigenética, Desmetilasa Específica de Lisina 1 (LSD1 por sus siglas en inglés) como un modulador de la expresión de NR4A1. LSD1 tiene una variante neuronal específica, neuroLSD1, que es necesaria para la diferenciación neuronal y participa en procesos como memoria, aprendizaje y respuesta a estrés. Ratones nulos para neuroLSD1 son menos propensos a mostrar un comportamiento ansioso, asociado con una menor inducción de IEGs comparado con ratones nativos. Los datos mencionados anteriormente nos llevan a proponer a LSD1 como un efector de las respuestas moleculares y de comportamiento mediadas por dopamina. Nuestros datos sugieren que la señalización a través de los receptores D2 de dopamina regulan la expresión de LSD1 y neuroLSD1. La administración aguda y crónica de anfetamina provoca cambios transitorios y a largo plazo en los niveles de LSD1, revelando un sistema de regulación negativa ejercido por neuroLSD1 sobre su propio gen. La caracterización neuroquímica y locomotora de ratones nulos para neuroLSD1 mostró una disminución en la liberación de dopamina, pero niveles similares de sensibilización locomotora cuando son tratados con anfetamina, en comparación a ratones nativos. Nuestros datos también muestran que tanto LSD1 como neuroLSD1 incrementan la actividad del promotor de NR4A1. Mediante el tratamiento con bicuculina de cultivos de neuronas hipocampales de ratones nulos para neuroLSD1 descartamos que neuroLSD1 es esencial para inducir la expresión de IEGs. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de una treonina específica de neuroLSD1 es un interruptor de la transcripción de los IEGs. En conclusión, mostramos que LSD1 y neuroLSD1 son lectores de los niveles sinápticos de dopamina y modulan la expresión de NR4A1, un gen ligado a la neurotransmisión de dopamina. Finalmente, utilizamos las bases de datos disponibles para identificar los genes blanco de NR4A1 en un esfuerzo por revelar su función.
- ItemUnveiling non canonical roles for RCOR1 and RCOR2 transcriptional co-repressors(2020) Rivera Álvarez, Carlos Andrés; Andrés Coke, María Estela; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias BiológicasLa familia de co-represores transcripcionales RCOR/CoREST comprende tres proteínas comúnmente asociadas a silenciamiento de genes neuronales en células no-neuronales y en etapas tempranas de la diferenciación neuronal. Su capacidad represora es llevada a cabo por las enzimas LSD1 y HDAC1/2, que remueven modificaciones post-traduccionales de histonas permisivas para la transcripción. Si bien las proteínas RCOR poseen alta identidad de secuencia en sus dominios funcionales, han evolucionado características bioquímicas específicas que explican por qué su capacidad represora es diferente. Paradójicamente, mientras los complejos de las proteínas RCOR han sido comúnmente asociadas a la represión de la transcripción en contextos celulares específicos, la inhibición de sus actividades enzimáticas asociadas genera un aumento en modificaciones de histonas que favorecen la transcripción, sugiriendo que el complejo actúa en dominios de eucromatina. El presente trabajo fue diseñado para caracterizar el rol de las proteínas RCOR1 y RCOR2 en dominios intranucleares asociados a expresión génica activa. En el capítulo 2, revelo a RCOR1 como un represor global de la transcripción que se recluta en dominios de eucromatina y controla la actividad de la RNA Polimerasa II. En el capítulo 3, describo a RCOR2 como un componente de speckles nucleares que estabiliza dichos organelos nomembranosos. En el capítulo 4, discuto la significancia de mis hallazgos y los relaciono con el estado del arte del campo. Finalmente, concluyo proponiendo un modelo para comprender funciones no canónicas de co-represores de la transcripción en regiones activas del genoma.