Identificación, selección e implementación de nuevos métodos para la biosíntesis de ironas.
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2018
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Abstract
Las ironas son compuestos cetónicos con aroma a violeta que se utilizan industrialmente en perfumería y alimentos, mercados relevantes y en expansión. Se sintetizan químicamente o se obtienen mediante la oxidación de sus precursores, cicloiridales. Éstos están presentes en las raíces de los lirios, aunque no se ha descrito su ruta metabólica de biosíntesis. El alto valor de mercado y demanda de ironas hace que el diseño de un proceso de síntesis biotecnológica sea de gran interés. Este trabajo propone y desarrolla un método para la síntesis de (-)-cis-α-irona a partir de α-ionona, mediante el uso de una enzima recombinante, modificada por mutagénesis sitio-dirigida. No se había reportado ninguna enzima que catalizara esta reacción, por lo que se seleccionó la fenilpiruvato metiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus (MppJ) como la mejor candidata mediante una comparación in silico. Luego, se modelaron mutaciones puntuales de MppJ para evaluar la orientación del sustrato, α-ionona, en el bolsillo catalítico, identificándose 13 mutantes apropiadas, según criterios de afinidad y distancia entre átomos relevantes. A continuación, se logró inducir la expresión de MppJ y sus 13 mutantes en Escherichia coli BL21(DE3). Finalmente, se evaluó la actividad de estas enzimas in vitro, en lisado celular, con su sustrato nativo, PPY, y con α-ionona. Se observó actividad con PPY en la enzima nativa y en dos de las mutantes: M240G/F287L y M240G/F287L/V328F. En los ensayos con α-ionona, no se detectó formación de ironas sobre 0,5 ppm ni de otros productos metilados. De esta forma, el presente estudio da un paso adelante en el camino para descifrar la vía metabólica alternativa que permitirá sintetizarlas.
Description
Tesis (Magíster en Ciencias de la Ingeniería)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2018