Characterization of the role of circadian clock input proteins in cyanobacteria
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Date
2025
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Abstract
Muchos organismos tienen relojes biológicos que anticipan la luz diaria. En cianobacterias, Synechococcus elongatus es el modelo clave, con un reloj circadiano basado en KaiA, KaiB y KaiC. La sincronización ambiental depende de KaiA y CikA, que usan un dominio pseudoreceptor ausente en Anabaena sp., cuyo reloj es funcional pero menos robusto. La tesis plantea que el dominio pseudoreceptor es clave en la regulación circadiana. Se realizó un análisis filogenético de proteínas circadianas en 4000 genomas de cianobacterias. Se encontró que el 60% de los genomas contienen los tres genes del oscilador central (kaiA, kaiB y kaiC), mientras que el 20% posee solo kaiB y kaiC, funcionando como relojes de arena. Los genes kaiA y cdpA fueron exclusivos del filo cianobacteriano, y las proteínas de entrada mostraron una alta variabilidad en dominios de detección de luz, reflejando una evolución adaptativa a diversos hábitats. Para evaluar el papel del dominio pseudoreceptor, se reemplazó KaiA de Synechococcus por su homóloga de Anabaena sp. que carece de dicho dominio. Estas cepas lograron estimular la autofosforilación de KaiC y mantener ritmos circadianos bajo ciclos de luz-oscuridad, pero no en luz constante, sugiriendo un funcionamiento tipo reloj de arena. Por tanto, el dominio pseudoreceptor no sería indispensable para la oscilación circadiana, pero sí para su sincronización con el entorno.
Numerosos organismos poseen un reloj biológico que les permite anticiparse y adaptarse al ciclo regular del día. En las bacterias, la cianobacteria unicelular Synechococcus elongatus ha sido el modelo predominante para estudiar estos mecanismos. Las proteínas KaiA, KaiB y KaiC forman el núcleo del reloj circadiano y funcionan como un oscilador regulado postraduccionalmente. La sincronización con el entorno está mediada principalmente por las proteínas de entrada KaiA y CikA, que detectan la luz indirectamente al unirse a las plastoquinonas a través de un dominio pseudoreceptor. Así pueden detectar cambios en los fotoperiodos. Es conocido que el dominio pseudoreceptor de las proteínas CikA y KaiA de Synechococcus elongatus está ausente en sus homólogas de Anabaena sp. En Anabaena sp.7120, el modelo más estudiado de cianobacteria multicelular se ha descrito un mecanismo circadiano funcional, aunque con oscilaciones menos robustas en comparación con otros sistemas de regulación circadiana, como es el caso de Synechococcus elongatus. Nuestra hipótesis es que el dominio pseudoreceptor tiene un papel fundamental en esta regulación circadiana. El objetivo de esta tesis es determinar la influencia del dominio pseudoreceptor en la respuesta circadiana. Para ello realizamos un análisis in silico a través del análisis filogenético de las proteínas que conforman el sistema circadiano de las cianobacterias, con énfasis en las proteínas de entrada, y determinamos cómo los cambios en sus dominios funcionales podrían afectar la robustez circadiana. Utilizamos una base de datos actualizada de 4,000 genomas de cianobacterias y realizamos una búsqueda exhaustiva de los genes relacionados con el sistema circadiano. A partir de los alineamientos, construimos árboles filogenéticos de máxima verosimilitud para cada una de las proteínas. Observamos que el 60% de los genomas presentan los tres genes del oscilador central (kaiA, kaiB y kaiC), mientras que solo el 20% tiene solo kaiB y kaiC, lo que define a estos últimos como relojes de arena. De los 18 genes analizados, solo dos (kaiA y cdpA) se encuentran exclusivamente en el filo de las cianobacterias. Los cambios más significativos en los dominios funcionales se observaron en las proteínas de entrada del reloj circadiano, en dominios críticos para la detección y sincronización con el ambiente. Esto sugiere que los procesos evolutivos han diversificado los mecanismos de entrenamiento circadiano, favoreciendo una mejor adaptación a diversos ambientes y hábitats. Aun así, no encontramos una influencia directa de los hábitats sobre la presencia de los genes circadianos, sin embargo, el análisis de morfología muestra que los genes de entrada son los más variables lo que pareciera estarse afectando por la morfología. Para determinar la influencia del dominio pseudoreceptor de las proteínas de entrada en la respuesta circadiana de Synechococcus elongatus, reemplazamos la proteína KaiA de Synechococcus elongatus por su homóloga de Anabaena sp., que carece del dominio pseudoreceptor. A través de la expresión heteróloga, obtuvimos cepas de Synechococcus elongatus que expresan la proteína KaiA de Anabaena sp. en el sitio neutro 1. Los ensayos de bioluminiscencia del reportero circadiano pKaiBC indicaron que la proteína KaiA de Anabaena sp. podía estimular la autofosforilación de KaiC de Synechococcus elongatus, mostrando un rendimiento circadiano superior comparado con la versión de KaiA de Synechococcus elongatus sin el dominio PsR (ΔkaiA181) construida en el laboratorio. Además, KaiA de Anabaena sp. complementa eficazmente el sistema circadiano de Synechococcus elongatus en condiciones de luz-oscuridad, pero no bajo luz constante, lo que sugiere que el reloj circadiano de Anabaena sp. podría operar como un reloj de arena. Estos resultados ilustran cómo la ausencia del dominio PsR en KaiA de Anabaena sp. afecta su capacidad para sincronizar y mantener ritmos circadianos en diferentes condiciones ambientales. La razón biológica por la cual el control circadiano en un sistema multicelular funciona como un reloj de arena en lugar de un reloj circadiano autosostenido sigue siendo una cuestión abierta. Esto podría estar relacionado con el hecho de que cada célula vegetativa en un filamento actúa como una unidad individual, sincronizándose con las demás células del filamento solo en la medida estrictamente necesaria.
Numerosos organismos poseen un reloj biológico que les permite anticiparse y adaptarse al ciclo regular del día. En las bacterias, la cianobacteria unicelular Synechococcus elongatus ha sido el modelo predominante para estudiar estos mecanismos. Las proteínas KaiA, KaiB y KaiC forman el núcleo del reloj circadiano y funcionan como un oscilador regulado postraduccionalmente. La sincronización con el entorno está mediada principalmente por las proteínas de entrada KaiA y CikA, que detectan la luz indirectamente al unirse a las plastoquinonas a través de un dominio pseudoreceptor. Así pueden detectar cambios en los fotoperiodos. Es conocido que el dominio pseudoreceptor de las proteínas CikA y KaiA de Synechococcus elongatus está ausente en sus homólogas de Anabaena sp. En Anabaena sp.7120, el modelo más estudiado de cianobacteria multicelular se ha descrito un mecanismo circadiano funcional, aunque con oscilaciones menos robustas en comparación con otros sistemas de regulación circadiana, como es el caso de Synechococcus elongatus. Nuestra hipótesis es que el dominio pseudoreceptor tiene un papel fundamental en esta regulación circadiana. El objetivo de esta tesis es determinar la influencia del dominio pseudoreceptor en la respuesta circadiana. Para ello realizamos un análisis in silico a través del análisis filogenético de las proteínas que conforman el sistema circadiano de las cianobacterias, con énfasis en las proteínas de entrada, y determinamos cómo los cambios en sus dominios funcionales podrían afectar la robustez circadiana. Utilizamos una base de datos actualizada de 4,000 genomas de cianobacterias y realizamos una búsqueda exhaustiva de los genes relacionados con el sistema circadiano. A partir de los alineamientos, construimos árboles filogenéticos de máxima verosimilitud para cada una de las proteínas. Observamos que el 60% de los genomas presentan los tres genes del oscilador central (kaiA, kaiB y kaiC), mientras que solo el 20% tiene solo kaiB y kaiC, lo que define a estos últimos como relojes de arena. De los 18 genes analizados, solo dos (kaiA y cdpA) se encuentran exclusivamente en el filo de las cianobacterias. Los cambios más significativos en los dominios funcionales se observaron en las proteínas de entrada del reloj circadiano, en dominios críticos para la detección y sincronización con el ambiente. Esto sugiere que los procesos evolutivos han diversificado los mecanismos de entrenamiento circadiano, favoreciendo una mejor adaptación a diversos ambientes y hábitats. Aun así, no encontramos una influencia directa de los hábitats sobre la presencia de los genes circadianos, sin embargo, el análisis de morfología muestra que los genes de entrada son los más variables lo que pareciera estarse afectando por la morfología. Para determinar la influencia del dominio pseudoreceptor de las proteínas de entrada en la respuesta circadiana de Synechococcus elongatus, reemplazamos la proteína KaiA de Synechococcus elongatus por su homóloga de Anabaena sp., que carece del dominio pseudoreceptor. A través de la expresión heteróloga, obtuvimos cepas de Synechococcus elongatus que expresan la proteína KaiA de Anabaena sp. en el sitio neutro 1. Los ensayos de bioluminiscencia del reportero circadiano pKaiBC indicaron que la proteína KaiA de Anabaena sp. podía estimular la autofosforilación de KaiC de Synechococcus elongatus, mostrando un rendimiento circadiano superior comparado con la versión de KaiA de Synechococcus elongatus sin el dominio PsR (ΔkaiA181) construida en el laboratorio. Además, KaiA de Anabaena sp. complementa eficazmente el sistema circadiano de Synechococcus elongatus en condiciones de luz-oscuridad, pero no bajo luz constante, lo que sugiere que el reloj circadiano de Anabaena sp. podría operar como un reloj de arena. Estos resultados ilustran cómo la ausencia del dominio PsR en KaiA de Anabaena sp. afecta su capacidad para sincronizar y mantener ritmos circadianos en diferentes condiciones ambientales. La razón biológica por la cual el control circadiano en un sistema multicelular funciona como un reloj de arena en lugar de un reloj circadiano autosostenido sigue siendo una cuestión abierta. Esto podría estar relacionado con el hecho de que cada célula vegetativa en un filamento actúa como una unidad individual, sincronizándose con las demás células del filamento solo en la medida estrictamente necesaria.
Description
TESIS EMBARGADA HASTA EL 01 DE SEPTIEMBRE DE 2027
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2025
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2025