3.06 Tesis doctorado

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El ácido palmítico reduce la sensibilidad a insulina de neuronas hipotalámicas: rol de la autofagia y del receptor FFAR1/GPR40
(2022) Toledo Valenzuela, Lilian Alejandra; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La diabetes mellitus tipo 2 es una compleja enfermedad metabólica caracterizada por una hiperglicemia crónica, que puede ser debida a una disminución en la sensibilidad a la insulina, a una reducción en su secreción o una combinación de ambas. El consumo de una dieta alta en grasas, abundante en ácido palmítico, favorece el desarrollo de esta enfermedad. El ácido palmítico disminuye la sensibilidad a la insulina en todo el organismo, incluyendo las neuronas hipotalámicas, que inhiben la producción de glucosa hepática (PGH) clave en la regulación de la glicemia. La acumulación hipotalámica de ácido palmítico reduce la supresión de la PGH, lo cual podría causar una menor sensibilidad a insulina en estos animales; sin embargo, esto aún no ha sido dilucidado. Respecto al mecanismo, se ha descrito que la activación por ácido palmítico del Receptor de Ácidos Grasos Libres 1 FFAR1/GPR40, disminuye la respuesta a la insulina en células β-pancreáticas, aunque no se ha evaluado si también reduce la sensibilidad a insulina en neuronas hipotalámicas, y si esto se traduce en una menor captación de glucosa mediada por insulina. Por otra parte, hemos demostrado que la autofagia, un proceso de degradación y reciclaje esencial para la homeostasis celular, se inhibe por la activación de FFAR1/GPR40 por ácido palmítico en neuronas hipotalámicas. La inhibición de la autofagia se asocia con una menor sensibilidad a la insulina en diversas células, por lo que resulta relevante evaluar si su bloqueo por ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. En base a la evidencia expuesta previamente, este proyecto está enfocado en determinar si el ácido palmítico, a través del receptor de ácidos grasos libres 1 (FFAR1/GPR40) y por medio de la inhibición de la autofagia, reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. Por otro lado, queremos determinar si la infusión intracerebroventricular (ICV) de ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en ratones C57BL/6. Nuestros resultados muestran que el ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina de las neuronas hipotalámicas por un mecanismo que incluye tanto la activación de FFAR1/GPR40 como defectos en la autofagia, reduciendo la activación de la vía PI3K/AKT y disminuyendo la captación de glucosa inducida por insulina en neuronas hipotalámicas. Finalmente, nuestros datos sugieren que la infusión hipotalámica de ácido palmítico reduce la tolerancia a la glucosa y disminuye los niveles plasmáticos de insulina en ratones C57BL/6. Este proyecto provee nueva información acerca de cómo el ácido palmítico favorece el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2, dando énfasis en la función de FFAR1/GPR40 en las neuronas hipotalámicas y considerando a la autofagia como un mecanismo de regulación de la sensibilidad a insulina en estas células. Estos resultados podrían ser un precedente para futuros estudios enfocados en el rol de la autofagia en neuronas hipotalámicas y su relevancia en la regulación de la glicemia.
Análisis del rol de la cutícula en la defensa de la vid ante el hongo necrotrófico Botrytis cinerea
(2022) Meyer Regueiro, Carlos José; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La cutícula es la estructura más externa de todos los tejidos aéreo de los organismos vegetales, por esta razón se encuentra en contacto inmediato con el medio circundante, interactuando con las distintas señales ambientales. Particularmente, es esta estructura la primera barrera que deben sobrepasar los patógenos fúngicos para colonizar el tejido aéreo vegetal. Por esta razón, su rol en la interacción planta-patógeno ha tomado relevancia en los últimos años. Se han propuesto tres mecanismos hipotéticos que podrían explicar las funciones de la cutícula en la interacción planta hongo: (1) Barrera física que impide la penetración del patógeno, (2) fuente de compuestos que afectan el desarrollo del hongo y (3) fuente de efectores percibidos tempranamente por la planta. Dentro del género Vitis, híbridos V. vinifera x V. labrusca presentan mayor grado de resistencia a este patógeno que su contraparte V. vinifera. Basados en la comparación de los componentes de la cutícula de ambas especies se determinó que en los cultivares derivados de V. labrusca existe una mayor acumulación de ácido ursólico, ácido olenólico y heintriacotano, moléculas que otorgan resistencia al hongo al ser asperjadas sobre bayas susceptibles. Este proyecto plantea estudiar la interacción entre B. cinerea y V. vinifera (híbridos V. vinifera x V. Labrusca) para contribuir a dilucidar cuál es el mecanismo de resistencia mediado por las ceras de la cutícula, a través de la caracterización de aspectos fisiológicos del ciclo infectivo del hongo en bayas de vid para dilucidar el componente principal de la resistencia a B. cinerea.
Análisis in vitro de los diferentes modos de unión a ADN de los factores de transcripción MarA y Rob
(2021) Geoffroy Jarpa, Consuelo Ignacia; Melo Ledermann, Francisco Javier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El proceso de reconocimiento molecular entre proteínas y ADN es fundamental para la vida. MarA y Rob son 2 factores de transcripción de Escherichia coli pertenecientes a la familia AraC/XylS, cuyos miembros presentan una alta similitud de secuencia y se encuentran relacionados a la regulación de genes involucrados en resistencia a antibióticos, tolerancia estrés oxidativo y resistencia a disolventes orgánicos y metales pesados [1]. La estructura de ambas proteínas incluye un dominio de reconocimiento a ADN organizado en un motivo HTH bipartito, con dos hélices clave en el reconocimiento de secuencias (Hélices 3 y 6). Adicionalmente Rob presenta un dominio regulatorio en el extremo C-terminal, cuya función aún no es bien conocida. Estudios cristalográficos previos, sugieren que ambos factores de transcripción reconocen y se unen a sus secuencias promotoras de forma distinta. Mientras que MarA interactúa con dos secuencias nucleotídicas clave denominadas cajas A y B de la región promotora y une ambas hélices al surco mayor del ADN deformándolo, Rob reconoce ambas cajas, pero tan solo se une a una de ellas sin alterar la estructura nucleica. En este estudio se abordan diferentes interrogantes y se combinan e integran datos experimentales, estadísticos y computacionales lo que permite comprender los mecanismos de reconocimiento y las diferencias planteadas. El factor de transcripción purificado se agregó in vitro a los distintos promotores degenerados y las secuencias unidas y no unidas se separaron. La estrategia general fue crear una biblioteca de sitios de unión potenciales, a partir de las secuencias unidas. Ambos extremos de las secuencias de la biblioteca tienen sitios de unión de partidores de modo que pudieron amplificarse mediante PCR y ser secuenciados mediante secuenciación masiva. Por otro lado los promotores degenerados abarcaron tanto el promotor mar como el promotor micF completo y se fueron cubriendo regiones de 4 nucleótidos. Esto permitió tener una mirada global de los factores que juegan un rol importante en el reconocimiento específico proteína-ADN. Los resultados claves de este estudio son: en primer lugar que la presencia o ausencia del dominio regulatorio, jugaría un rol en la especificidad del reconocimiento proteína-ADN. En segundo lugar, la región espaciadora no aportaría especificidad a la unión, pero sí jugaría un papel clave en cuanto a la estabilidad de la unión. Y finalmente se concluye que Rob presenta dos modos de unión alternativos en donde presenta contacto directo con el surco mayor del ADN a través de la hélice 3 y la hélice 6 o bien interactúa principalmente sólo con caja A a través de hélice 3.
Analysis of the metabolic features of plant extremophile species from the Atacama desert
(2022) Dussarrat, Thomas; Gutiérrez Ilabaca, Rodrigo Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal
Los sitios extremos situados en los márgenes de al menos un gradiente abiótico permiten la supervivencia de muy pocas especies. Estas especies denominadas extremófilas (literalmente que aman los extremos) albergan una reserva única de adaptaciones genéticas y bioquímicas que siempre han atraído la curiosidad humana. Estudios anteriores han demostrado un alto grado de especificidad para la adaptación de las especies de plantas a biomas hostiles, lo que explica que las transferencias exitosas de esas adaptaciones a los cultivos sigan siendo escasas. Sin embargo, también pueden existir estrategias adaptativas genéricas o más generales. En este contexto, me propongo utilizar un enfoque integral desde el ecosistema hasta los metabolitos para investigar las adaptaciones bioquímicas de las especies vegetales extremófilas del desierto de Atacama, el desierto no polar más seco del planeta. Las plantas se recogieron en su entorno natural, que abarca un gradiente de altitud de 2500 a 4500m. Se combinaron múltiples enfoques metabolómicos con el aprendizaje automático o “machine learning” para develar una serie de herramientas genéricas para la resistencia de las plantas a las duras condiciones del Atacama. Posteriormente, los análisis de enriquecimiento de reacciones y vías metabólicas identificaron los legados genéticos subyacentes a las estrategias bioquímicas convergentes seleccionadas evolutivamente. Por último, se exploró el rol de las interacciones positivas con el cactus Maihueniopsis camachoi en la adaptación de varias especies a las extremas condiciones ambientales. Los resultados permitieron comprender mejor los procesos de facilitación y descubrir un novedoso conjunto de metabolitos capaces de predecir el estado de la interacción. Finalmente, este estudio aporta información importante para comprender los mecanismos de adaptación que subyacen a la resistencia de las plantas a los climas extremos, y nuestro enfoque multiespecífico presagia estudios y descubrimientos prometedores en agronomía y ecología.
Antecedentes de la invasión de la especie exótica Lycalopex griseus (Zorro Gris o Chilla) en Isla Grande de Tierra del Fuego, Chile
(2021) Zurita Redón, Carlos Nicolás Felipe; Jaksic Andrade, Fabián; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Se realiza una recopilación bibliográfica de los datos sobre la invasión de Lycalopex griseus (Zorro Gris) en la Isla Grande de Tierra del Fuego con el objetivo de describir y analizar los antecedentes publicados sobre la introducción, invasión y efectos de Lycalopex griseus en dicho lugar. Se sabe que este cánido fue introducido en la Isla en 1951 de manera voluntaria para ejercer un control biológico sobre las poblaciones de Conejo Europeo (Oryctolagus cuniculus) que, a esa fecha, se estimaban sobre 30 millones de individuos. Este lagomorfo vio disminuida sus abundancias poblacionales a raíz de la introducción de la enfermedad viral mixomatosis que provocaba su muerte, en tanto que el Zorro Gris comenzó a aumentar sus abundancias sin haber ejercido eficazmente su rol putativo de controlador biológico. Para esto, se hace una revisión con ayuda de Google Académico y algunos criterios de búsqueda para encontrar literatura al respecto. Se evidencia que esta es escasa, y aporta datos antiguos que requieren actualización. Entre los datos recopilados, destacan antecedentes sobre su nicho trófico, donde se muestra que este cánido incorpora ítems dietarios diversos, como vegetales y micromamíferos; además, datos sobre sus poblaciones que muestran los sectores de la isla donde con mayor probabilidad de avistamiento de Zorros Grises. En conclusión, se hacen necesarios nuevos esfuerzos de muestreo para actualizar la información y resolver otras incógnitas que han sido planteadas en la literatura por años, como la eficacia y eficiencia de los zorros como controladores biológicos de conejos.
Astrocytes from the retrotrapezoid nucleus drives chemoreceptor neuron hyper-responsiveness to hypercapnia in heart failure: role of oxidative stress and glutamate spill-over
(2024) Díaz Jara, Esteban; Río Troncoso, Rodrigo Andre del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La insuficiencia cardiaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una enfermedad crónica caracterizada por una alta prevalencia de desórdenes respiratorios e irregularidades en el patrón ventilatorio, las cuales están estrechamente asociados con la potenciación del quimiorreflejo central. El principal núcleo quimiorreceptor central es el núcleo retrotrapezoide (RTN), ubicado en la superficie del tronco encefálico, que contiene neuronas que frente a un estímulo hipercápnico propagan potenciales de acción excitatorios hacia los centros respiratorios, modulando el patrón respiratorio. En modelos preclínicos de ICFEP, la eliminación selectiva de las neuronas quimiorreceptoras del RTN normaliza la quimiorrefleja central y elimina la irregularidad en el patrón respiratorio. Sin embargo, los mecanismos celulares que potencian la función del RTN durante la ICFEP no se han estudiado previamente. En los últimos años, se ha demostrado que, además de las neuronas quimiorreceptoras, los astrocitos ubicados en el RTN desempeñan un papel clave en la regulación de la quimiorrecepción en condiciones normales. Sin embargo, se desconoce el rol de estas células en el control de la quimiorecepción central durante la ICFEP. Por lo tanto, propuse como hipótesis que "El estrés oxidativo aumenta el impulso del quimioreflejo central en la ICFEP al reducir la captación de glutamato mediada por los astrocitos en el núcleo retrotrapezoide". Los objetivos principales de esta tesis doctoral fueron: i) Determinar los niveles de estrés oxidativo y glutamato en el RTN y estudiar la contribución del estrés oxidativo en las respuestas exageradas del quimiorreflejo central en ratas con ICFEP; ii) Determinar las alteraciones en la morfología de los astrocitos y la localización y expresión del transportador de glutamato-1 (GLT-1) en el RTN de ratas con ICFEP; iii) Determinar la actividad neuronal en secciones del tronco encefálico que contienen el RTN de ratas con ICFEP; y iv) Determinar si la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de ratas con ICFEP restaura la respuesta normal de las neuronas quimiorreceptoras a la hipercapnia. La ICFEP fue inducida en ratas Sprague Dawley machos adultos (~250 g) mediante una fístula arteriovenosa. Se utilizó pletismografía de cuerpo entero para evaluar tanto la respuesta ventilatoria a la hipercapnia (FiCO2 7%), como el patrón respiratorio en reposo. Los niveles del anión superóxido y de superóxido dismutasa 2 en el RTN se determinaron por tinción con dihidroetidio (DHE) y Western Blot, respectivamente. La morfología de los astrocitos y los niveles de GLT-1 en el RTN se determinaron mediante inmunofluorescencia y RNAscope, respectivamente. La localización celular de SOD2 y de GLT-1 se realizó mediante análisis bioinformáticos. Los niveles de glutamato extracelular en el RTN se midieron en animales anestesiados, y posteriormente mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para evaluar la actividad de las neuronas quimiorreceptoras RTN, se realizaron inyecciones estereotáxicas de un adenovirus que permitió la expresión de un sensor de calcio citoplasmático (GCaMP6s) en las neuronas. Posteriormente se analizaron los cambios de fluorescencia en las secciones del tronco encefálico que contenían el RTN mediante microscopía confocal. Finalmente, la sobreexpresión de GLT-1 en astrocitos RTN fue realizada por la inyección estereotáxica de un adenovirus que permitió la expresión del transportador de glutamato-1 bajo el promotor específico de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los animales con ICFEP presentaron un aumento en los niveles del anión superóxido en el RTN, los cuales están estrechamente relacionados con la potenciación del quimiorreflejo central en animales ICFEP. El aumento de los niveles de superóxido en el RTN se asoció con la disminución en los niveles de expresión de SOD2, tanto a nivel de mRNA y proteína, en los animales con ICFEP. En paralelo, animales con una disminución parcial de SOD2 presentan un aumento en los niveles de superóxido en el RTN los cuales se correlacionan con la potenciación del quimiorreflejo central, similar a lo observado en animales con ICFEP. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que SOD2 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN en lugar de en las neuronas quimiorreceptoras. Las ratas con ICFEP presentan un aumento en los niveles de glutamato extracelular en el RTN tanto en condiciones basales como durante el estímulo hipercápnico comparado con animales Sham. Tanto las ratas con ICFEP como en animales con una disminución parcial de SOD2 presentan una disminución en la morfología de los astrocitos del RTN. Interesantemente se observó que los animales con ICFEP presentan una disminución en la tinción de NMB, el marcador de neuronas quimiorreceptoras del RTN. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que GLT-1 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN y no en las neuronas quimiorreceptoras, y que en los animales con ICFEP, existe una disminución en los niveles de GLT-1 en el RTN. Las neuronas quimiorreceptoras del RTN de animales con ICFEP presentan un aumento de actividad tanto en condiciones basales como al ser expuestas a un medio ácido. Finalmente, la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de animales con ICFEP normaliza la actividad de las neuronas quimiorreceptoras del RTN. Además, la sobreexpresión de GLT-1 normaliza los niveles extracelulares de glutamato en el RTN, el quimiorreflejo central y el patrón respiratorio en animales con ICFEP. Estos resultados sugieren que el aumento del estrés oxidativo y la disfunción de los astrocitos en el RTN juegan un rol clave en la potenciación del quimiorreflejo y en la progresión de la ICFEP, principalmente a través la recaptación del glutamato extracelular.
Aumento de proliferación y neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis en respuesta a la sobre expresión de Lin28
(2022) Herrera Rojas, Mauricio Alejandro; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En humanos un daño a la médula espinal se considera irreversible, sin embargo, existen animales con alta capacidad regenerativa tales como el pez cebra, el ajolote y la rana Xenopus laevis los cuales son capaces de regenerar la médula espinal después de un daño, recuperando las conexiones y movilidad perdida producto de la lesión. Para el estudio de la regeneración de la médula espinal, Xenopus laevis presenta ventajas que lo hacen un modelo único de estudio. En etapas pre-metamórficas es un animal con la capacidad de regenerar la médula, mientras que durante y después de la metamorfosis, este animal pierde esas capacidades, por lo que se transforma en un animal no regenerativo. Estudios de nuestro laboratorio utilizando a Xenopus laevissugieren que, para que ocurra regeneración de la médula espinal en estadios regenerativos, es necesario la activación de progenitores neurales identificados como células Sox2+. Al analizar los niveles de expresión de Sox2, se ha visto que estos disminuyen a medida que la rana avanza el desarrollo (metamorfosis). Por lo tanto, se determinó que la disminución de Sox2, podría ser una causa del porqué la rana pierde las capacidades regenerativas en estadios pre-metamórficos. La pregunta que surge en cuestión es ¿existe algún factor que pueda regular a los progenitores neurales Sox2+ y promover la neurogénesis para la regeneración de la médula espinal? Cimadamore en el 2013 demostró que la sobre expresión exógena de la proteína de unión a RNA Lin28 era suficiente para rescatar a los progenitores neuronales de un defecto proliferativo en los estadios más tempranos de la neurogénesis, asociados a la pérdida de Sox2. En el mismo año, el grupo de Shyh-Chang demostró que se mejoraba la regeneración acelerando el recrecimiento de cartílagos, huesos y tejido mesenquimal después de la amputación de los dígitos distales o la perforación de las orejas en los animales. Por último, una expresión constitutiva de Lin28 en células P19, causó un bloqueo completo de glicogénesis acompañado de un incremento en la neurogénesis. Estos antecedentes nos hacen pensar Lin28 podría ser un factor preponderante para inducir la regeneración en la médula espinal mediante la regulación de los progenitores neurales Sox2+. En base a esto, nosotros presentamos la siguiente hipótesis: La sobre expresión de Lin28 produce un aumento de proliferación celular y de la neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis. Nuestros resultados muestran que hay un aumento significativo de la proliferación de progenitores Sox2 en la médula espinal de la rana producto del daño y que a través de los métodos clásicos de estudio de la neurogénesis con la utilización de un marcador de neurona madura NeuN, se observó que existe neurogénesis en respuesta al daño en estadios regenerativos de Xenopus laevis, por lo tanto, la neurogénesis podría ser un posible mecanismo por el cual la rana puede regenerar la médula espinal después de una daño. Además, los ensayos de sobre expresión de Lin28a en estadios regenerativos demostraron que esta proteína de unión a RNA, regularía la proliferación celular aumentando la actividad de las células progenitoras e induciría la diferenciación celular hacia un fenotipo neuronal generando un aumento en la neurogénesis en la médula espinal en ausencia de daño. Por lo tanto, nosotros creemos Lin28a sería un buen candidato de estudio para la regeneración de la médula espinal de Xenopus laevis a través del aumento de la neurogénesis.
B3 transcription factors regulate iron distribution in A. thaliana embryos
(2021) Grant Grant, Susana Margarita; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El hierro es un macronutriente esencial para todos los seres vivos. En humanos, la deficiencia de hierro en la dieta es la principal causa de anemia en el mundo. La Organización Mundial de la Salud a propuesto la biofortificación de cultivos como una alternativa para aumenta el contenido de hierro en los alimentos. Uno de los cultivos más consumidos en la dieta humana son las semillas. Sin embargo, poco se conoce sobre la acumulación del hierro en semillas. En Arabidopsis thaliana durante la maduración del embrión el hierro se acumula en las vacuolas de la capa celular que rodea la provasculatura. En A. thaliana y otras plantas modelo se han identificado tres factores de transcripción B3, FUS3 (FUSCA3), LEC2 (LEAFY COTYLEDON2) y ABI3 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3), que cumplen una función crítica en la acumulación de compuestos de almacenaje como proteínas y lípidos en la semilla durante la maduración. La función de los factores de transcripción B3 en la maduración y la acumulación de compuestos de almacenaje ha sido bien estudiaba, sin embargo, la función de estos factores de transcripción B3 en la acumulación de micronutrientes como el hierro no ha sido estudiada. En este trabajo se estudió el rol de los factores de transcripción B3 en la homeostasis de hierro en semillas de A. thaliana, utilizando mutantes para los factores de transcripción B3 y técnicas histológicas y de biología molecular. En este trabajo se determinó que los factores de transcripción B3 participan en la regulación de la distribución de hierro en semillas de A. thaliana, pero no así el contenido total de hierro en semilla. Los resultados de este trabajo mostraron que los genes asociados a la homeostasis de hierro cambiaron su expresión en las semillas mutantes para los factores de transcripción B3. Este cambio en la expresión coincide con el fenotipo heterocrónico de las semillas mutantes en los genes de los factores de transcripción B3. Finalmente, a través de una Red de Regulación Génica se encontró un nuevo rol para la vía de respuesta a etileno asociado a la distribución de hierro en semillas. Estos resultados entregan algunas respuestas sobre la regulación de la homeostasis de hierro en semillas, a pesar de que aún quedan muchas preguntas sin respuesta, como, por ejemplo: ¿Cómo el etileno regularía la distribución de hierro en semillas? y ¿Qué factores de transcripción regulan directamente a los genes asociados a la homeostasis de hierro?
Calcifying phytoplankton in natural laboratories for understanding ocean acidification
(2021) Díaz Rosas, Francisco Javier; Dassow, Peter von; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los cocolitofóridos son organismos fitoplanctónicos unicelulares caracterizados por una cobertura de placas de calcita, los cocolitos, que son producidos dentro de la célula. Estos calcificadores, como uno de los principales grupos funcionales planctónicos, juegan un rol importante en el ciclo del carbono inorgánico y posiblemente como lastre hundiendo carbono orgánico hacia el océano profundo. La mayoría de los esfuerzos para entender las respuestas de los cocolitofóridos hacia la acidificación del océano (AO) –o el aumento del CO2 atmosférico reduce el pH y estado de saturación (Ω) de CaCO3 del océano– ha sido a través de experimentos de laboratorio, principalmente usando un pequeño set de cepas de la especie más cosmopolita y fácilmente cultivable Emiliania huxleyi. Esta especie resulta particularmente interesante ya que es joven (~ 291.000 años) y se ha adaptado a un amplio rango de ambientes marinos. Sin embargo, este no es el único cocolitofórido y aun dentro de esta especie hay mucha diversidad fenotípica y genética y respuestas diversas hacia la AO en el laboratorio. A pesar de los esfuerzos realizados aun no es claro como los efectos fisiológicos bajo condiciones controladas se trasladan a respuestas de campo a nivel de comunidad. Esta tesis buscó contribuir a entender este asunto estudiando la distribución, composición y nicho realizado de ensambles de cocolitofóridos y morfotipos de E. huxleyi en ambientes con niveles contrastantes de pCO2/pH/Ωcalcita del Pacífico Sureste, y evaluar las respuestas de diferentes morfotipos de E. huxleyi a niveles de pCO2/pH ajustados en el laboratorio. Para esto, se muestrearon los cocolitofóridos en una sección costera-oceánica, aguas mesotróficas, sistemas de surgencia, y fiordos-canales de Patagonia. De un total de 40 especies, E. huxleyi fue la más prevalente (30-100 % abundancia relativa). Dentro de este taxón, varios morfotipos han sido descritos como estables en cultivo y diferenciados genéticamente (e.g., los morfotipos A y R). El morfotipo A moderadamente-calcificado dominó las poblaciones de E. huxleyi siendo sólo superado por el morfotipo R altamente-calcificado en sistemas de surgencia con alto pCO2/bajo pH. Este cambio abrupto en composición de las poblaciones de E. huxleyi sugirió que estos ambientes costeros mantienen reservorios genéticos para su adaptación a la AO. Por consiguiente, se probó la hipótesis que aquellas formas están adaptados para resistir condiciones de alto pCO2/bajo pH. Inesperadamente, los morfotipos del Pacífico Sureste no fueron más sensibles que las cepas altamente-calcificadas desde aguas contiguas con alto pCO2/bajo pH (disminuyeron las tasas de crecimiento y razón PIC/POC). Por otro lado, análisis de nicho realizado mostraron que el morfotipo A posee un nicho más amplio y tolerante a cambios ambientales (i.e., generalista) que el nicho del morfotipo R, especializado en aguas con alto pCO2/bajo pH. La falta de evidencia de adaptación local a condiciones de alto pCO2/bajo pH en E. huxleyi, podría ser explicado por una estrecha respuesta unimodal hacia Ωcalcita revelado por el análisis de nicho que no fue testeado experimentalmente. Alternativamente, el morfotipo R altamente-calcificado podría ser seleccionado por una condición particular del Pacífico Sureste no identificada que se correlaciona con temperatura, salinidad y Ωcalcita de su nicho realizado. En suma, a pesar de poseer rápidas tasas de reemplazo y grandes tamaños poblacionales, organismos planctónicos oceánicos no necesariamente exhiben adaptaciones a la surgencia de aguas con alto CO2, y este ubicuo cocolitofórido podría estar cerca del límite de su capacidad para adaptar a la AO en curso.
Caracterización biomecánica del proceso de NETosis en suspensión
(2022) Morales Camilo, Nicole; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las NETs son fibras de cromatina descondensada que forman una red compuesta mayoritariamente por ADN e histonas y proteínas antimicrobiales, consecuencia del mecanismo de muerte celular programada llamada NETosis, para la generación de una barrera física que previene la diseminación de patógenos. La NETosis es un proceso dinámico que implica transformaciones significativas en el citoesqueleto y el núcleo celular, y con ello, cambios significativos en las propiedades mecánicas celulares; sin embargo, la caracterización de este proceso en un contexto cercano al fisiológico no ha sido abordado. Este trabajo busca estudiar la biomecánica del proceso de NETosis en suspensión utilizando una aproximación interdisciplinaria. Para medir los cambios morforeológicos del proceso de NETosis en flujo se adaptó la metodología de RT-DC y determinó el módulo de Young (elasticidad) de los neutrófilos estimulados. El RT-DC corroboró que la NETosis inducida por PMA es independiente al proceso de adhesión, en condiciones de flujo. Así también, el análisis de los gráficos área versus deformación obtenidos por el RT-DC, permitió la clasificación y caracterización de subpoblaciones celulares, y comprobar la generación de NETs en suspensión. Finalmente, la caracterización morforeológica de estos neutrófilos muestran un aumento significativo en su tamaño celular (>30 µm2) y cambios de elasticidad con una fase inicial “rápida” de aumento en la rigidez y luego una fase “lenta” de disminución de la rigidez. Este estudio proporcionó evidencia necesaria para relacionar las características biomecánicas de la NETosis con el mecanismo molecular y la temporalidad descrita para este proceso, en un contexto cercano al fisiológico.
Caracterización de los genes MIT1 y MIT2 de Arabidopsis Thaliana que codifican para transportadores mitocondriales de hierro
(2021) Vargas Pérez, Joaquín Ignacio; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Entre los micronutrientes esenciales para las plantas, el hierro es aquel que se requiere en mayor abundancia ya que es componente de cofactores como hemo y centros hierro azufre, que participan en procesos como la fotosíntesis y la respiración, entre otros. Importantes avances han permitido conocer los mecanismos que rigen la homeostasis del hierro a nivel fisiológico en las plantas, sin embargo a nivel subcelular existen aún muchas interrogantes. En este contexto, las mitocondrias son organelos con un alto requerimiento de hierro ya que albergan parte de la ruta de síntesis de centros hierro azufre y utilizan numerosos cofactores de hierro en la cadena transportadora de electrones, que en total suman al menos 9 hemos y 13 centros hierro azufre, por lo que la función mitocondrial y el metabolismo del hierro se encuentran estrechamente relacionados. Se ha estudiado poco la homeostasis del hierro mitocondrial en plantas y poco se sabe de los transportadores involucrados. Recientemente fue descrito el primer transportador de hierro mitocondrial en plantas, llamado Mitochondrial Iron Transporter (MIT) en Oryza sativa y codificado por un gen esencial. En base a este transportador identificamos dos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, At1g07030 (MIT1) y At2g30160 (MIT2). La expresión de estos genes en levaduras mutantes en los transportadores mitocondriales de hierro de alta afinidad les permite a estas levaduras crecer en medio deficiente en hierro, lo que sugiere fuertemente que MIT1 y MIT2 transportan hierro a la mitocondria en levaduras. Para caracterizar la función de MIT1 y MIT2 se obtuvieron 3 líneas homocigotas mutantes para MIT1 y 2 líneas homocigotas mutantes para MIT2, y ninguna de ellas presentó alteraciones en su fenotipo. Además la segregación del alelo mutado en la descendencia de plantas heterocigotas tampoco mostró alteraciones. Estos resultados sugieren que ambos genes son redundantes, lo que fue confirmado al cruzar líneas mutantes nulas mit1 y mit2 y no poder obtenerse dobles homocigotas mutantes. Este resultado demostró además que la función MIT es esencial en Arabidopsis. Al cruzar una mutante nula de MIT2 y una “knockdown” de MIT1 fue posible obtener plantas dobles homocigotas mutantes que en la primera generación expresaban un 10-20 % de MIT1. Estas plantas resultaron ser viables y presentaron múltiples alteraciones fenotípicas: embriones con tres cotiledones, retraso en la germinación, en el crecimiento post-germinativo y durante todo el desarrollo. Además, se encontraron anormalidades morfológicas en semillas, hojas, flores y tallos. Parte de estas alteraciones podría explicarse directamente por una disfunción mitocondrial generada por deficiencia de hierro en el organelo, lo que se sustenta en la inducción de genes marcadores de respuesta a perturbación/estrés mitocondrial. Otra parte de las alteraciones podría estar relacionada con un efecto indirecto de la perturbación mitocondrial sobre la homeostasis de auxina. El análisis de los datos transcriptómicos revela que estas plantas tienen probablemente reprimida la adquisición de hierro, la síntesis de cumarinas, la formación de la banda de Caspari, la suberización y el desarrollo de los pelos radiculares. Y tienen aumentada la expresión de genes relacionados con desarrollo y mantención de meristemas, formación y límites de órganos, desarrollo de flores. Curiosamente estas plantas dobles homocigotas mutantes recuperaron un fenotipo normal en la siguiente generación, lo que se correlaciona con un aumento de la expresión de MIT1 (70% a nivel de transcrito y 30% a nivel de proteína, respecto de plantas silvestres), probablemente debido al mecanismo descrito de “supresión de T-DNAs intrónicos”. Estas plantas “compensadas” no son diferentes de plantas silvestres en actividad mitocondrial, en el proteoma mitocondrial y en el transcriptoma.
Characterization of OPA1 disease-related mutations and their effect on mitochondrial fusion dynamics, cristae organization and calcium homeostasis
(2020) Cartes Saavedra, Benjamín Tomás; Eisner Sagüés, Verónica Raquel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La fusión de la membrana interna mitocondrial y la forma de las crestas mitocondriales son dependientes de la proteína OPA1. Mutaciones en el gen de OPA1 provocan una enfermedad llamada Atrofia Óptica Autosómica Dominante (ADOA), la cual es una de las principales causas de ceguera hereditaria. Los dominios GTPasa y el dominio effector de la actividad GTPasa (GED) son esenciales para el papel de OPA1 en su actidiad de fusión, sin embargo, el papel específico que cumple cada dominio en las funciones de OPA1 aun son aún desconocidos. Interesantemente, pacientes con mutaciones en el domino GTPasa tienen un mayor riesgo de desarrollar síntomas multisistémicos. En este estudio, se analizaron mutaciones de OPA1 en los dominios GTPasa y GED para entender la contribución de cada dominio a la función de la proteína, mediante experimentos con células de pacientes con ADOA or experimentos de ganancia de función en líneas celulares. Las mutantes de OPA1 en el dominio GTPasa y GED mostraron alteraciones diferenciales en la ultraestrcutrua mitocondrial. Además, la presencia de todas las mutantes inhibieron la actividad de fusión de las mitocondrias, sin embargo, algunas mutantes del dominio GTPasa presentaron una red mitocondrial hiperelongada. En este trabajo encontramos que el dominio GED es crucial para una actividad GTPasa adecuada. Sin embargo, el dominio GED, a diferencia del dominio GTPasa, no es requerido para mediar la fusión de las mitocondrias. Además, pesar de que el GED es un dominio de interacción con proteínas, este no sería necesario para formar oligomeros de OPA1. Finalmente, estudiamos el papel de OPA1 y sus dominios en la homeostasis del calcio intracelular, encontrando que la proteína, a través de su dominio GED, cumple un papel importante en la transferencia del calcio desde el Retículo Endoplásmico hacia la mitocondria. En resumen, las mutantes dominio-específicas de OPA1 muestran caracteríticas y funciones diferentes en la ultraestrcutura mitocondrial, acitidad de fusión de las mitocondrias y homeostasis del calcio intracelular, pudiendo ser éstas funciones clave en la severidad y progresión de la enfermedad de ADOA.
“Characterization of the effects induced by ADAR1 over long non-coding RNAs A-to-I editing and expression levels in breast cancer”
(2020) Rojas de Santiago, Pamela Roxana; Armisén Yáñez, Ricardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La enzima Adenosina desaminasa que actúa sobre ARNs 1 (ADAR1, del inglés Adenosine deaminase acting on RNAs 1) ha sido ampliamente descrita como un factor modulador de la edición, niveles de expresión y función de sus ARNs blancos, pudiendo ser estos codificantes y no-codificantes. Entre los últimos, los ARNs largos no-codificantes (lncRNAs, del inglés long non-coding RNAs) (> 200 nt de largo) se han destacado por ser componentes centrales en procesos celulares tanto fisiológicos como patológicos. En cáncer de mama, ambos ADAR1 y lncRNAs, han sido caracterizados como elementos clave en vías de señalización oncogénicas y supresoras de tumores. Sin embargo, sólo unos pocos reportes en la literatura abordan la relación ADAR1-lncRNAs, quedando mucho por entender a escala transcriptómica. Por este motivo, esta tesis está enfocada principalmente en abordar los efectos inducidos por ADAR1 tanto en los niveles de expresión como en la edición de lncRNAs y cómo esto podría estar relacionado a la progresión del cáncer. Mediante el uso de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq), detectamos que ADAR1 puede modular la expresión de varios lncRNAs, encontrando que el RNA 944 intergénico largo no codificante (LINC00944) respondía de forma consistente a la ganancia y pérdida de función de ADAR1. Al analizar los datos de pacientes de la cohorte de cáncer de mama de The Cancer Genome Atlas (TCGA-BRCA), encontramos que bajos niveles de LINC00944 se correlacionan con fenotipos malignos, como una fracción menor de infiltración linfocitaria en el microambiente tumoral (TILs, del inglés tumor-infiltrating lymphocytes) y con una disminución en la expresión de marcadores pro-apoptóticos. En la misma línea, encontramos que una baja expresión de LINC00944 se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes, ya que la disminución en su expresión se correlacionó con una reducción en la supervivencia general y supervivencia libre de recaídas. La sobreexpresión de ADAR1 se ha asociado a un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama triple-negativo (TNBC, del inglés triple-negative breast cancer). Al analizar la cohorte de TCGA-BRCA, demostramos que ADAR1 induce la edición A-por-I en aproximadamente el 10% de los lncRNA expresados en tumores TNBC. Asimismo, encontramos que éstos transcritos fueron editados en una alta proporción. En la presente tesis, nosotros ilustramos dos ejemplos de cómo la edición A-por-I podría estar alterando la función de lncRNAs: ya que PVT1 presentó el mayor número de posiciones editadas, hipotetizamos que su función de lncRNA esponja está siendo diversificada por la edición A-por-I y de esta forma permitiendo la progresión del cáncer. Por otro lado, planteamos la hipótesis de que la capacidad de PINK1-AS1 para estabilizar su ARNm sentido PINK1, puede verse alterada mediante la edición del lncRNA en tumores TNBC y que, en este contexto, podría ser maligna.
Characterization of the Enterobacteriaceae-associated ROD21-like family of excisable genomic islands and study of excision in the pathogenicity island ROD21
(2021) Piña Iturbe, Luis Alejandro; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las islas genómicas (IGs) son elementos adquiridos horizontalmente que juegan un papel importante en la evolución del genoma y la adaptación bacteriana a diferentes ambientes, ya que estos elementos transfieren genes que codifican diferentes funciones ventajosas para la bacteria, por ejemplo: la capacidad de metabolizar nuevos sustratos, la resistencia a los antimicrobianos o la virulencia, entre otras. Además de estas funciones, muchas IGs también contienen un módulo de escisión/integración que incluye los genes que codifican la maquinaria molecular (la enzima integrasa y el factor de direccionalidad de recombinación) y las regiones reguladoras necesarias que promueven una reacción de recombinación específica de sitio. Esta reacción da como resultado la escisión de la isla del cromosoma como un elemento circular que puede ser el sustrato para la transferencia por conjugación o puede reintegrarse. De manera interesante, se ha encontrado evidencia que el estado escindido/integrado de algunas IGs tiene un rol en la virulencia de las bacterias en su hospedador, aunque por ahora, este fenómeno se ha observado solamente en dos IGs. La creciente disponibilidad de genomas bacterianos secuenciados ha permitido la identificación y caracterización de varias IGs las cuales han sido clasificadas en diferentes familias que comparten un set conservado de genes implicados en los procesos de transferencia y escisión, que comparten vías reguladoras comunes. La identificación y clasificación de las IGs permite comprender mejor su evolución, sus interacciones con su hospedador y los mecanismos reguladores que rigen su transferencia a otras bacterias. Sin embargo, muchas IGs aún no han sido clasificadas y la comprensión de su biología sigue siendo limitada. La Región de Diferencia 21 (ROD21, por sus siglas en inglés) es una isla de patogenicidad escindible y movilizable que codifica algunos factores de virulencia involucrados en la infección producida por Salmonella enterica serovar Enteritidis, un patógeno transmitido por alimentos y una de las serovariedades de Salmonella de mayor prevalencia en el mundo. Los experimentos realizados con cepas mutantes de Salmonella ser. Enteritidis que tienen una capacidad reducida o alterada para escindir ROD2, mostraron un defecto en estas cepas para invadir órganos internos en el modelo murino de infección. Un resultado que puede estar relacionado con los cambios observados en la expresión de los genes en ROD21 y en otros loci genómicos. Sin embargo, aunque la escisión de ROD21 tiene un rol en la virulencia de Salmonella ser. Enteritidis, se conoce muy poco acerca de la regulación de este proceso. ROD21 también está presente en los serovares Gallinarum y Dublin, y aunque se ha reportado la existencia de “islas relacionadas con ROD21”, no se conoce más acerca de este tema. En esta Tesis Doctoral, se utilizaron diferentes herramientas bioinformáticas para identificar islas relacionadas con ROD21 y analizar su filogenia y contenido genético. Estos análisis revelaron que ROD21 pertenece a una familia de islas genómicas presentes en diferentes cepas de bacterias patógenas de plantas y animales del orden Enterobacterales, la cual fue denominada Enterobacteriaceae-associated ROD21-like (EARL). El análisis filogenético sugiere que la familia EARL se originó en bacterias patógenas de plantas y que la adquisición de genes específicos permitió su diseminación a diversos hospedadores bacterianos. Se encontró también que, si bien estas islas codifican grupos de genes variables y conservados, el módulo de escisión/integración fue la única región conservada en las 56 islas identificadas, incluida ROD21, hallazgo que destaca la naturaleza escindible de la familia EARL como se demostró para dos de sus miembros albergados por Klebsiella pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos cepa KP35 y Escherichia coli enteropatógena O127:H6 cepa E2348/69. Cabe destacar que las islas EARL poseen genes que codifican homólogos cortos y de longitud completa del regulador transcripcional global H-NS, una proteína involucrada en la regulación de funciones bacterianas importantes como la virulencia y la transferencia horizontal de genes. Como parte del módulo de integración /escisión conservado, se caracterizaron el gen SEN1998 y su producto proteico purificado para evaluar su rol en la escisión de ROD21. Si bien SEN1998 codifica un factor de direccionalidad de recombinación capaz de unirse a las regiones de ADN involucradas en el proceso de escisión, la deleción de este gen solo produjo una ligera reducción en el nivel de escisión. Sorpresivamente, los niveles de expresión de SEN1998 resultaron estar correlacionados negativamente con la escisión de ROD21, una característica que también se observó para el gen SEN1970 que codifica la integrasa. A pesar de estos hallazgos, no está claro si la represión de SEN1998 y SEN1970, la cual ocurrió inmediatamente antes que comenzara a aumentar la escisión, está relacionada a la regulación de este proceso. En resumen, los resultados de esta Tesis amplían el repertorio de islas genómicas escindibles identificadas, presenta información sobre su evolución y proporciona un primer acercamiento a la comprensión de la regulación de la escisión en la isla de patogenicidad ROD21. Estos hallazgos podrían contribuir a una mejor comprensión de los patógenos actuales y emergentes como lo son las diferentes serovariedades de Salmonella, E. coli patógena y K. pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos, entre otros.
Characterization of the MYB60 Gene of Phaseolus vulgaris and its Role in Regulating Stomatal Aperture
(2024) Martínez Barradas, Vera Isabel; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal
In this thesis the Phaseolus vulgaris MYB60 gene was characterized, and it is pointed as a promising candidate to improve its tolerance to drought stress. The specific objectives were: Characterize the ‘Zorzal’ cultivar physiological and yield response to drought stress in greenhouse. Identify, clone, and characterize the MYB60 gene of Phaseolus vulgaris orthologous to Arabidopsis thaliana including its coding region and promoter. Establish an in vitro regeneration protocol for the “Zorzal” common bean cultivar and design gRNAs that can be furtherly used for its edition. Zorzal presented physiological traits associated with drought tolerance. However, these traits are insufficient to maintain a stable yield under severe drought stress at the pre-flowering stage.Phaseolus vulgaris has a PvMYB60 ortholog gene to the MYB60 of Arabidopsis thaliana, with stomata-specific expression that is involved in promoting stomatal aperture.An in vitro regeneration method was developed that allows successful fertile plant regeneration of ‘Zorzal’ common bean by direct organogenesis from embryonic axis and embryonic apical meristem explants, with regeneration rates of 58.3 and 21.1% respectively, that together with the designed gRNAs provide a potential tool for genetic manipulation of Zorzal cultivar and common bean in general.
Considering local knowledge in adaptive capacity of local communities at the land-sea interface
(2023) Barceló Carvajal, Matías Paulo; Gelcich, Stefan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Globally, coastal communities are facing changes and threats to biodiversity and food security. A major driver of change relates to declining productivity of fisheries and agriculture in coastal areas that depend on land and sea. Terrestrial and marine ecosystems provide diverse benefits to people through ecosystem services, such as food supply, coastal protection, climate regulation and cultural experiences. Since land-sea interactions can negatively affect the livelihoods of communities, it is important to understand how this interaction affects different ecosystem services at the land-sea interface and, consequently, human well-being. One way that coastal communities cope with these changes is through their adaptive capacity, i.e., their ability to respond to and anticipate change. An important indicator of adaptive capacity is local knowledge, which can help to cope with environmental threats that negatively affect natural resources. The objectives of this thesis are i) to identify approaches, tools and knowledge gaps on the study of land-sea interactions in their relationship with ecosystem services; ii) to assess the relationship between local knowledge, values and livelihoods to identify emerging synergies or trade-offs in this relationship; and iii) to assess how different dimensions of adaptive capacity, including local knowledge, determine the adaptive capacity of coastal communities. For the first objective, a systematic literature review of publications was conducted through Web of Science, using keywords on land-sea interaction. For objectives two and three, we conducted semi-structured interviews in local communities in the Valdivian coast, southern Chile. We assessed local knowledge, values and livelihoods. In addition, we assessed dimensions of adaptive capacity such as agency, social capital, institutions, local knowledge and assets, to determine their role in past and hypothetical future responses to resource depletion scenarios. The systematic review identified 166 publications. The results indicate that the main disciplines that have investigated land-sea interactions were biogeochemistry and ecology, with a focus on nutrients. Regarding ecosystem services, supporting and regulating services were the most investigated, with urbanization and agricultural and forestry effluents as the main topics of study. On the other hand, we highlight the low number of studies that include management strategies and social components in land-sea interaction. Regarding the second objective, the results show heterogeneity in the relationship between values and livelihoods: there are communities that may lose knowledge and values when they expand their livelihoods and communities that do not. Certain types of livelihood diversification strategies may result in constraints that can affect knowledge transmission and differences in the type of values. Finally, the results of objective three show the critical role of local knowledge in adaptive capacity in past and future responses to hazards that may affect resource-dependent local communities. These results highlight the importance of including local knowledge in an adaptive capacity framework. Our results demonstrate the knowledge gaps that exist at the land-sea interface and the importance of beginning to understand the role of local knowledge in the adaptive capacity of coastal communities in order to improve resource management practices at the land-sea interface and move towards more sustainable futures.
Contribution of Fc gamma receptors to the pathology induced by human metapneumovirus in a murine model
(2020) Acevedo Acevedo, Orlando Andrés; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El Metapneumovirus humano (MPVh) es una de las principales causas de infecciones graves de las vías respiratorias inferiores y de hospitalización en niños menores de cinco años. La evidencia clínica indica que estos casos graves de infección por MPVh se acompañan de una infiltración masiva de neutrófilos orquestada por la acción coordinada de macrófagos y células dendríticas (CDs). Sin embargo, los mecanismos que regulan esta respuesta inflamatoria siguen siendo poco conocidos. Las evidencias de otros estudios destacan el papel de los receptores de la porción Fc de la inmunoglobulina G (FcγRs) en la modulación de la función y el reclutamiento de las CDs, así como de los macrófagos y neutrófilos durante la inflamación. Como parte de la tesis doctoral, investigamos el papel del receptor de IgG murino canónicamente inhibidor FcγRIIb y canónicamente activador FcγRIII en la respuesta de neutrófilos desencadenada por la infección por MPVh. Además, también determinamos si la falta de tales receptores regula la infiltración de macrófagos y CDs que, además de los neutrófilos, orquestan la respuesta innata frente al MPVh. Utilizando neutrófilos purificados, también examinamos el papel putativo del MPVh y del MPVh opsonizado con IgG en la forma de inmuno-complejos de MPVh (MPVh-ICs) en la regulación de la expresión de ambos receptores, que a su vez pueden modular la función de los neutrófilos en un contexto in vivo. Con una estrategia similar, también determinamos si estos estímulos regulan la apoptosis de los neutrófilos, la producción de especies reactivas de oxígeno (EROS), así como la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (TENs), que en conjunto pueden contribuir a una mayor inflamación de las vías respiratorias después de la infección por MPVh. Los resultados de este estudio indican que la infección por MPVh produce daño pulmonar, evidenciado como un aumento de la puntuación de histopatología pulmonar en ratones WT en comparación con controles no infectados, que no se observó en ratones FcγRIIb- /- y ratones FcγRIII - /- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen a la inflamación desencadenada por MPVh en los pulmones. Además, la infección por MPVh aumenta el número medio de neutrófilos viables en las vías respiratorias y pulmones de ratones WT, pero no en ratones FcγRIIb -/- y FcγRIII-/- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen al reclutamiento de neutrófilos y después de la infección por MPVh. Además, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII atenúa el incremento de Macrófagos intersticiales (MIs) en el pulmón y lavado broncoalveolar de ratones WT luego de la infección con MPVh los cuales en conjunto con los neutrófilos podría contribuir a la obstrucción de las vías respiratorias durante la infección. En contraste, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII evita la reducción en los niveles de Macrófagos Alveolares (MAs) viables que se observa después de la infección de ratones WT y que de acuerdo con estudios previos podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos en las vías aéreas y el tejido pulmonar. Por otro lado, también demostramos que el MPVh opsonizado con IgG y el MPVh por si solo previenen la apoptosis constitutiva de neutrófilos purificados los que a su vez desencadenan la producción de EROS y TENs que en conjunto pueden contribuir al daño pulmonar producida por la infección de MPVh. En conclusión, nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la interacción entre FcγRs específicos y MPVh opsonizado con IgG podría usarse como una nueva estrategia terapéutica para prevenir la respuesta inflamatoria pulmonar contra este virus. En este contexto, el uso de anticuerpos monoclonales con porciones Fc modificadas y que reconozcan proteínas de superficie de MPVh, que pueden activar FcγRs distintos de FcγRIIb y FcγRIII, podría usarse como tratamientos profilácticos o terapéuticos novedosos para disminuir la inflamación pulmonar causada por la infección con MPVh.
Control of motivation for palatable food by kappa opioid receptor signaling and the neuropeptide Orexin-A
(2023) Sandoval Caballero, Carolina Loreto; Pérez Leighton, Claudio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Eating is a motivated behavior that provides nutrients to allow life. Animals evolved to perceive food as a positive reinforcer, resulting in increased motivation for food when the animal is hungry and decreased motivation when it is satiated. Motivation evolved to seek and eat food in an environment of food scarcity; however, it can become maladaptive in an environment with plenty food access, favoring excessive eating, weight gain, and obesity. Understanding the neuronal mechanisms regulating food motivation could improve therapies against obesity.Opioids and the hypothalamic Orexin/Dynorphin neurons are part of the brain mechanisms that regulate food intake and motivation for food. Opioids bind mainly to three G-protein coupled receptors (kappa, mu, and delta), which are expressed in brain regions that regulate food intake and motivation. Still, the contribution of each opioid receptor to food intake and motivation for food is unclear. The Orexin/Dynorphin neurons co-release the excitatory neuropeptides Orexins (e.g., Orexin-A and Orexin-B) and the inhibitory opioids Dynorphin (e.g., Dynorphin-A 1-13) into different areas, including the Oxytocin neurons from the paraventricular hypothalamic nucleus. The effects of Orexin and Dynorphin peptides in eating behavior are brain-site specific. For example, in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 increases and Orexin-A decreases palatable food intake (i.e., tasty food, generally high in sugars and fats). Still, the opposite effect is observed in the ventral tegmental area. Dynorphin-A1-13 binds mainly to the kappa opioid receptor, which is expressed in the anorexigenic oxytocin neurons of the paraventricular hypothalamic nucleus; however, whether inhibition of oxytocin neurons is involved in the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 in the paraventricular hypothalamic nucleus is unknown. Also, in this brain region, Orexin-A blocks the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13. Still, it is unclear whether these effects are mediated by changes in motivation for palatable food and whether the endogenous kappa opioid receptor signaling in the paraventricular hypothalamic nucleus regulates motivation for food. We hypothesize that in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 signaling through the kappa opioid receptor promotes motivation for sucrose, and Orexin-A inhibits this behavior. We evaluated this hypothesis through four specific aims. [1] To determine through a meta-analysis the effects of kappa, mu, and delta opioid receptor ligands on food intake and motivation. We found that: (1) agonists increased food intake after central injections while antagonists decreased food intake after central and peripheral injections. (2) We did not find differences between the effects of opioid receptor ligands on standard rodent food intake after injections in the paraventricular hypothalamic nucleus compared to other brain sites. (3) Mu agonists had the strongest orexigenic effect compared to kappa and delta agonists, with the most significant effect on fat intake. (4) Whereas only centrally administered kappa antagonists reduce feeding, peripherally administered antagonists for all opioid receptor subtypes reduce feeding; (5) peripheral administration of antagonists decreases motivation for food regardless of food type. [2] To determine whether in the paraventricular hypothalamic nucleus signaling through kappa opioid receptor mediates the ability of Dynorphin-A1-13 to increase motivation for sucrose. We assessed motivation for sucrose using a progressive ratio schedule in which mice must perform work licks to obtain sucrose. After each sucrose reward obtention, there was a 20 sec time-out period in which licks were recorded, but sucrose could not be obtained. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to the vehicle: (1) bilateral administration of the kappa opioid antagonist nor-binaltorphimine increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work and time-out licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. These effects were also found after subcutaneous administration of nor-binaltorphimine. (2) Unilateral Dynorphin-A1-13 administration increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing time-out licks. (3) Bilateral Dynorphin-A1-13 administration did not change the time to obtain sucrose rewards. However, it strongly decreased sucrose work licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. Also, nor-binaltorphimine did not block Dynorphin-A1-13 effects. Finally, we could not downregulate the expression of the kappa opioid receptor in the paraventricular hypothalamic nucleus and thus, these effects in motivation for sucrose were not performed. [3] To determine whether oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus express the kappa opioid receptor and whether blocking the kappa opioid receptor activates Oxytocin neurons in this brain region. Published data demonstrated that the kappa opioid receptor is expressed in oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus. Thus, we assessed whether nor-binaltorphimine activates oxytocin neurons and decreases food intake in mice. We found that nor-binaltorphimine administration in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased cafeteria diet intake and abolished the negative correlation between the percentage of active caudal oxytocin neurons and cafeteria diet intake established after vehicle injection. [4] To determine whether activation of the kappa opioid receptor by Dynorphin-A1-13 and orexin receptors by Orexin-A in the paraventricular hypothalamic nucleus have opposing effects on motivation for sucrose. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to vehicle (1) Unilateral Orexin-A administration increased sucrose work and time-out licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing the time to obtain sucrose rewards and time-out licks. (2) Orexin-A decreases the demotivational effects of Dynorphin-A1-13.We conclude that signaling through orexin and opioid receptors modulates feeding behaviors and motivation for food. Those effects depend on variables including the dose and administration route of the drug, food tested, and circadian period in which the outcomes were measured. Dynorphin-A1-13 and nor-binaltorphimine in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased sucrose work licks, and Orexin-A blocked the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 over time. We reasoned that the demotivational effects of nor-binaltorphimine could involve the activation of anorexigenic oxytocin neurons, and the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 could be explained by their signaling through other receptors besides the kappa opioid receptor, such as Mu opioid receptor. We conclude that during the active phase of the mice, Orexin-A potentiates the orexigenic mechanisms that are naturally active in mice and increases locomotion and motivation. Consequently, the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 could not be detected because orexigenic mechanisms reached a ceiling effect. Thus, instead of promoting motivation for sucrose, Dynorphin-A1-13 prompts allodynia that decreases feeding and motivated behaviors.
Coupling cell communication and optogenetics: implementation of a light-inducible intercellular system in yeast
(2023) Rojas Jorquera, Vicente Alberto; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La comunicación celular es un fenómeno extendido en biología, permitiendo la transmisión de información acerca de las condiciones del entorno. Con el fin de entender cómo la comunicación celular modula procesos biológicos relevantes, diferentes sistemas sintéticos basados en inducción química han sido exitosamente desarrollados. En este trabajo, se acopló la comunicación celular y la optogenética en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La aproximación consiste en dos poblaciones conectadas por la producción dependiente de luz de la feromona factor-α en un tipo celular, que induce la expresión génica en el otro grupo de células. Después de la caracterización individual de tres variantes de ambas cepas, el sistema intercelular optogenético fue evaluado combinando las diferentes células bajo condiciones contrastantes de iluminación. Usando luciferasa como gen reportero, co-cultivos específicos a una proporción 1:1 muestran activación de la respuesta bajo luz azul constante, lo que no fue observado para las mismas mezclas crecidas en oscuridad. Entonces, el sistema fue evaluado en varias transiciones oscuridad/luz azul, donde el nivel de respuesta varia dependiendo del momento en el que la iluminación fue entregada. Además, la amplitud de la respuesta puede ser ajustada modificando la proporción inicial entre ambos tipos de cepa. También, células expresando todas las partes del circuito sintético se generaron para verificar si la separación de actividades biológicas mejora el rendimiento general del sistema. En ese contexto, el sistema de dos poblaciones mostró mayores veces de inducción en comparación con cepas autónomas. Esta exitosa implementación del sistema intercelular optogenético abrió la oportunidad de expandir el repertorio de las cepas de levadura involucradas variando componentes de la vía de señalización como reguladores negativos y promotores de respuesta a feromona. Así, se obtuvieron diversas versiones del sistema, que muestran un amplio rango de niveles de respuesta bajo regímenes de inducción por luz. En general, estos resultados demuestran que la información externa de la luz es propagada a través de una molécula de señalización difusible para modular la expresión génica en un sistema sintético de células microbianas, lo que pavimentará el camino para estudios que permitan el control optogenético de dinámicas a nivel de población.
Decoding the mobilome of marine microbial communities and their composition in response to local environmental conditions
(2022) Tamayo Leiva, Javier; Diez Moreno, Beatriz; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La transferencia horizontal de genes es un proceso natural que permite que los genomas celulares evolucionen rápidamente al adquirir nuevos rasgos genéticos. Entre los cinco procesos celulares capaces de realizar la transferencia horizontal de genes, la conjugación es el más frecuente. Este mecanismo está implicado en el intercambio de vectores de ADN, llamados elementos genéticos móviles y aquí colectivamente denominados como mobiloma conjugativo. El ambiente marino muestra de forma habitual un dinamismo especialmente elevado. Por esta razón, han existido esfuerzos de investigación de la ecología y diversidad microbiana a gran escala, y por ello es un candidato ideal para el estudio del moviloma ambiental. El objetivo de esta tesis fue caracterizar la estructura y prevalencia del moviloma conjugativo en el bacterioplancton de la superficie oceánica. Para ello, se ha examinado el moviloma conjugativo, primeramente, desde metagenomas marinos públicos (TARA Ocean Project) en un gradiente geográfico. Y posteriormente en una sucesión estacional (dos años) en el observatorio costero de Montemar (Viña Del Mar, Chile). Para identificar el moviloma, se utilizaron modelos ocultos de Markov para la búsqueda de marcadores moleculares como relaxasas, integrasas y el sistema de secreción del tipo 4 (T4SS). Nuestros resultados revelan que los elementos movilizables -elementos que requieren asistencia para ser conjugados- son más abundantes, y superan en número a las secuencias auto-conjugativas. Esto sugiere la cooperación entre secuencias del moviloma. Además, muestran que la adaptación moviloma-huésped favorece una prevalencia del moviloma asociado a los taxa dominantes en el sistema marino a escala temporal como geográfica.

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