3.01 Tesis doctorado

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Development of rule-based models for regulatory mechanisms of gene expression and bacterial metabolism
(2020) Santibáñez Palominos, Rodrigo Alberto; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El modelado de sistemas es un amplio campo en ciencias e ingeniería enfocado en entender cómo los componentes de un sistema evolucionan a través del tiempo y espacio. Por siglos, el modelado ha sido usado para la descripción de una variedad de sistemas simples y con la llegada de la computación, hemos sido capaces de modelar sistemas altamente detallados, analizarlos y proponer hipótesis para posterior testeo experimental. En esta tesis doctoral, la utilización de modelos basados en reglas fue propuesta para el rápido desarrollo de modelos borradores describiendo la regulación de la expresión génica bacteriana. La metodología desarrollada es capaz de modelar transcripción, traducción y la degradación de macromoléculas así como también el metabolismo bacteriano. Los procesos anteriormente mencionados son esenciales para la viabilidad celular, aunque el modelado es ampliamente adoptado para el metabolismo. Para sobrepasar el lento desarrollo de modelos, la proposición de modelado está acompaña por el desarrollo de herramientas computacionales para modelar automáticamente cada proceso, una técnica previamente disponible solo para modelos metabólicos. La regulación de la expresión génica es esencial para la homeostasis celular y adaptación. Esta regulación depende de factores transcripcionales y otras proteínas que unen específicamente secuencias de ADN y controlan programas genéticos. Sin embargo, la complejidad de esta red regulatoria impide esfuerzos para modelar regulación génica a escala genómica. En primer lugar, nosotros proponemos una metodología construida sobre Kappa BioBrick Framework, la cual fue automatizada y extendida para describir correctamente la arquitectura del genoma, la iniciación de la transcripción bacteriana, e incorporar el metabolismo. Desarrollamos Atlas, un software que es capaz de convertir las muchas interacciones y reacciones codificadas en redes biológicas en modelos basados en reglas. Reglas son similares a ecuaciones químicas describiendo únicamente las características involucradas en una reacción. Al hacer eso, una regla puede representar miles o incluso millones de reacciones individuales. El método fue empleado con datos conocidos de regulación génica y reacciones metabólicas de la bacteria Escherichia coli. Luego, desarrollamos Pleione, un software que emplea un algoritmo genético para calibrar modelos basados en reglas. La herramienta da soporte a cuatro simuladores estocásticos (compatible con dos lenguajes de reglas). Pleione distribuye simulaciones y cálculos de bondad de ajuste en infraestructuras de computación de alto rendimiento, y más importantemente, aprovecha pruebas estadísticas de equivalencia para determinar la pertinencia de simulaciones estocásticas a datos experimentales. También desarrollamos herramientas para estimar la incertidumbre en calibración de parámetros y para estimar índices de sensibilidad de parámetros seleccionados por el usuario. El modelado es visto como una tarea especializada, inaccesible sin el conocimiento apropiado de métodos de modelado. Atlas toma inspiración en herramientas disponibles para reconstruir borradores de modelos metabólicos a escala genómica, y esta tesis satisfactoriamente presenta una biblioteca de software para desarrollar y analizar modelos basados en reglas para regulación génica y metabolismo en bacteria. Las herramientas desarrolladas permiten evaluar el impacto de modificaciones como variación del número de copias génicas, arquitectura del genoma, y otras modificaciones génicas comunes para entender la fisiología bacteriana, patogenicidad, y eventualmente, la ingeniería de células bacterianas para aplicaciones de biotecnología y biomedicina. Las herramientas presentadas en esta tesis doctoral son de código abierto y disponibles libremente para descarga desde el Índice de Paquetes de Python y desde github.com/networkbiolab/pleione y github.com/networkbiolab/PythonCyc.
Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Oenococcus oeni and its functional analysis in malolactic fermentation
(2021) Cañón Amengual, Pablo Martín; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Oenococcus oeni es el agente principal de la fermentación maloláctica en vinos, responsable de la descarboxilación del ácido L-málico a ácido L-láctico. Es un proceso clave en la vinificación, reduciendo la acidez y aportando complejidad aromática y estabilidad microbiológica, pero es errático e impredecible Pese a su rol crucial, el proceso no es aún entendido del todo. Para mejorar la comprensión de la bacteria y el proceso, se construyó y curó el primer modelo metabólico a escala genómica de O. oeni cepa PSU-1 (iSM454). Luego, se estudió su crecimiento bajo distintas condiciones de etanol, determinando la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares, y, por último, se generó un modelo por homología de la enzima maloláctica. Los experimentos in silico revelaron que el modelo iSM454 predice los requerimientos nutricionales con una exactitud del 93%. Luego, éste se aplicó para determinar la energía de mantención no asociada a crecimiento. Los resultados mostraron que el O. oeni cultivado al 12% de concentración de etanol gastaba treinta veces más ATP para mantenerse vivo que en su ausencia. La mayor parte de este ATP era empleado en la extrusión de protones fuera de la célula. Los experimentos in vitro se llevaron a cabo en MaxOeno, un medio de cultivo definido y similar al vino, desarrollado y optimizado para el estudio. La integración de los datos experimentales con el modelo permitió determinar la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares bajo diferentes condiciones de etanol (0 a 12% v/v). Se identificaron claramente cuatro fases de crecimiento durante el cultivo por lote de la cepa PSU-1 del O. Oeni, según el consumo de los ácidos málico y cítrico, la absorción de azúcares y aminoácidos, y las tasas de biosíntesis de productos metabólicos – biomasa, eritritol, manitol y ácido acético, entre otros. Se halló que, bajo condiciones de etanol crecientes, el O. oeni favorece reacciones anabólicas relacionadas con el mantenimiento celular, mientras los requerimientos de NAD(P)+ y ATP aumentan. Finalmente, se usó un modelo por homología de la enzima maloláctica y la técnica de quantum polarized ligand docking para describir el sitio de unión y ubicación del ácido L-málico (MAL) y sus estados desprotonados MAL- y MAL2-. MAL2- tuvo el más bajo ΔGbinding, seguido por MAL- y MAL, con valores de −23.8, −19.6 y −14.6 kJ/mol, respectivamente, consistente con los valores obtenidos en los ensayos de titulación de calorimetría isotérmica (ITC). Los resultados de dinámica molecular y de MM/GBSA sugieren que sólo el MAL2- exhibe una conformación abierta extendida en el sitio de unión, que cumple los requerimientos geométricos para la coordinación con Mn2+, componente crítico de la actividad de la enzima maloláctica. Se espera que iSM454 y el modelo de homología para la enzima maloláctica descritos aquí, provean herramientas únicas para comprender y predecir la compleción de la fermentación maloláctica en el vino por O. Oeni, así como los inconvenientes que el proceso puede eventualmente afrontar en cualquier condición físico-química particular.
Genomic characterization of Cylindrospermopsis raciborskii : a cyanobacterium able to produce bioactive compounds
(2019) Fuentes Valdés, Juan José; Garrido Cortés, Daniel; Vásquez Pérez, Luz Mónica; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Las cianobacterias son microorganismos esenciales para la vida, ya que, desarrollan el proceso de fotosíntesis y fijación de nitrógeno atmosférico. Los compuestos producidos por estos microorganismos tienen un potencial biotecnológico destacable, sin embargo, también son responsables de generar intoxicaciones graves producto del consumo de agua contaminadas, como es el caso de la intoxicación por la toxina saxitoxina. Avances en genómica y bioinformática han facilitado el descubrimiento de nuevos compuestos además de ayudar a comprender su evolución cianobacteriana y diseminación en el medio ambiente. En esta tesis, mediante un enfoque molecular se buscó e identificó un grupo de compuestos bioactivos, además de proporcionar una caracterización molecular y química de las moléculas identificadas. El primer objetivo fue obtener las secuencias genómicas de aislamientos de Cylidrospermopsis raciborskii australianos y desarrollar un análisis de genómica comparativa, para comprender su relación genética con la especie brasileña Raphidiopsis brookii, con un enfoque especial en la producción de saxitoxina. En general, observamos una fuerte correlación biogeográfica entre las cepas analizadas. La comparación genómica del grupo C. raciborskii y R. brookii mostró un alto grado de similitud en términos globales, sin embargo, se observaron diferencias significativas en términos de la biosíntesis de metabolitos secundarios. En segundo lugar, los clústeres de genes para metabolitos secundarios identificados en los genomas de Cylindrospermopsis, se estudiaron a nivel molecular. Se determinó el potencial de C. raciborskii para producir compuestos activos del tipo hassallidinas y saxitoxinas. Usando LC-MS / MS determinamos el perfil de hsasallidina en C. raciborskii CS-505, e identificamos una nueva variante de hassallidina en la cepa CS-509. Curiosamente, no logramos detectar hassallidina en extractos de C. raciborskii CS-508, a pesar de la presencia del cluster de genes aparentemente completo. Esto podría explicarse por mecanismos reguladores o mutaciones puntuales. Finalmente, determinamos el perfil de saxitoxina en la cepa C. raciborskii MVCC14, que resultó ser el mismo perfil identificado en R. brookii D9. Cylindrospermopsis raciborskii y Raphidiopsis brookii se clasifican morfológicamente como especies diferentes, mediante análisis de genómica comparativa los datos sugieren que ambos podrían ser miembros de la misma especie. En resumen, este trabajo proporcionó información importante referente a genomas cianobacterianos, determinando las estructuras genéticas responsables de la producción de metabolitos secundarios de compuestos de importancia biotecnológica como hassallidina y saxitoxina.
Heterologous production of the epoxycarotenoid violaxanthin in Saccharomyces cerevisiae
(2020) Cataldo von Bohlen, Vicente Francisco; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
La producción de carotenoides en microorganismos se ha centrado en moléculas clásicas como β-caroteno, licopeno y astaxantina. Sin embargo, existen carotenoides menos estudiados que también poseen interesantes propiedades y aplicaciones. Este es el caso de la violaxantina, un epoxicarotenoide presente en plantas, que posee una potente actividad antioxidante y es precursor de otras moléculas de interés comercial como la β-damascenona y la fucoxantina. En este trabajo se reportan por primera vez cepas de levadura productoras de epoxicarotenoides. Para esto, utilizando herramientas de ingeniería metabólica a varios niveles, se construyeron cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae capaces de producir violaxantina. En primer lugar, partiendo de una cepa β-carotenogénica, se evaluaron enzimas β-caroteno hidroxilasas (CrtZ/CrtR-b2) y zeaxantina epoxidasas (ZEP) de diferentes especies, en conjunto con sus versiones truncadas en diversas posiciones aminoterminales. El mejor desempeño se logró con la expresión combinada de una CrtZ de Pantoea ananatis y una ZEP truncada de Haematococcus lacustris, llevando a un rendimiento de violaxantina de 1.6 mg/gDCW. Posteriormente, con el objetivo de incrementar la actividad epoxidasa, se co-expresaron diferentes sistemas accesorios de oxidorreducción, que promueven la transferencia de equivalentes reductores hacia la enzima ZEP. La co-expresión de una ferredoxina-3 truncada y una ferredoxina oxidorreductasa-1 truncada incrementó el rendimiento de biosíntesis de violaxantina en 2.2 veces (3.5 mg/gDCW). Finalmente, un aumento en el número de copias de los genes carotenogénicos permitió incrementar el rendimiento de este carotenoide a 7.3 mg/gDCW, que corresponde al mejor rendimiento de violaxantina producida en microrganismos reportado hasta la fecha.
In vitro and ex vivo study of the emamectin benzoate absorption in the intestine of Atlantinc salmon (Salmo Salar)
(2022) Molina Regalado, Leidy Victoria; Franco, Wendy; Pérez C., José Ricardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El Salmón Atlántico representó el 80,7% de la salmonicultura en Chile en 2021, generando más de 2.500 millones de dólares en ventas. Sin embargo, la alta densidad de los cultivos ha proliferado el piojo de mar Caligus rogercresseyi, que infesta al salmón y causa Caligidosis. El benzoato de emamectina (EB) se ha utilizado para controlar la enfermedad; sin embargo, ha generado resistencia en el parásito debido a sus dosis subletales provocadas por su baja solubilidad acuosa e inestabilidad en pH ácidos, lo que implica baja absorción y un tratamiento incompleto. La microencapsulación puede proteger el fármaco y permitir su liberación en un sitio específico. Además, forma dispersiones sólidas amorfas en las que aumentan el área superficial y los sitios activos entre el fármaco y el polímero, mejorando la disolución del fármaco. La microencapsulación, mediante secado por aspersión (SD) o gelificación iónica (IG), es crucial para proteger y mejorar la disolución de fármacos poco solubles en agua. Este estudio plantea la hipótesis de que se pueden aplicar técnicas de optimización multicriterio para diseñar micropartículas de EB con varias propiedades mejoradas. Las propiedades consideradas fueron digestión intestinal (ID), digestión gástrica (GD), rendimiento (Y), eficiencia de encapsulación (EE) y capacidad de carga (LG). La metodología para obtener micropartículas EB óptimas con secado por aspersión Soluplus® y gelificación iónica de alginato (ALG) consistió en: i) la aplicación y comparación de dos métodos de optimización multicriterio que priorizaban la digestión, el enfoque de función de deseabilidad (DFA) y la optimización multiobjetivo (MOO ) que buscan el frente de Pareto, ii) evaluación de disolución/permeación de EB en el medio intestinal de salmón usando membranas sintéticas y biológicas (intestino proximal), iii) caracterización física y química (estado físico de EB dentro de micropartículas, interacciones EB/polímero , forma, carga superficial, distribución de tamaños y estabilidad de las micropartículas con sales del medio intestinal) de las micropartículas de EB con la mayor disolución/permeación. Los principales resultados de esta investigación son: i) Cada método de optimización produjo diferentes soluciones óptimas. En SD, la solución óptima DFA arrojó LC, GD y ID más altos que MOO, en un 7,5 %, 9,3 % y 2,1 %, respectivamente. Por el contrario, la solución óptima de MOO obtuvo Y y EE más altos que DFA en un 6,2 % y un 10,1 %, respectivamente. En IG, el método DFA arrojó una solución con mejores respuestas que MOO en LC (3.7%), GD (7.4%) y ID (3.2%), mientras que la solución MOO fue mejor en Y (14.2%) y EE (19.3 %). ii) Las micropartículas de IG mostraron una disolución/permeación de 0,45 mg/mL (80,2 %), una permeación aparente de 6,2 mg/mL en RS–L (solución Ringer-membrana lipofílica), una captación de 7,3 % en RS (solución Ringer), y una solubilidad aparente del 53,1% en medio EM (emulsión). Estas micropartículas reducen la dosis terapéutica a 3,0-2 mg/mL y 1,1-2 mg/mL para EB en EM y RS, respectivamente. La encapsulación de EB por gelificación iónica es una opción prometedora para aumentar la absorción de EB. iii) EB microencapsulada por gelificación iónica modificó su estado físico. Los nuevos enlaces entre EB y ALG mejoraron su afinidad hidrofílica y lipofílica. Se detectó el intercambio iónico entre Ca2+ y los iones de algunas sales del intestino. El estado físico, la forma, la interacción y el intercambio de Ca2+ aumentaron la disolución de EB. Nuestros resultados indican que las micropartículas de EB alginato son una mejor opción para dosificar EB al salmón Atlántico que EB libre o las micropartículas de EB Soluplus®. La metodología aplicada en esta tesis es útil para diseñar micropartículas de fármacos poco solubles que muestran varias propiedades mejoradas.
Mathematical modeling of space-time variation in acoustic transmission and scattering from schools of swim bladder fish
(2015) Raveau Morales, María Paz; Escauriaza Mesa, Cristián Rodrigo; Feuillade, Christopher; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Se utiliza un enfoque de ecuaciones diferenciales acopladas para investigar las variaciones espaciales y temporales de la propagación acústica de cardúmenes y burbujas. Este método incorpora coherentemente las interacciones acústicas entre individuos. El presente trabajo consiste en tres secciones principales:(1) El modelo descrito es usado para investigar las propiedades acústicas de cardúmenes en la dirección de la onda incidente (dirección posterior). Se presentan los resultados de un análisis de datos de transmisión, obtenidos en 1995 durante un experimento realizado en el Golfo de Lion en el mar Mediterráneo. El presente análisis conduce a estimaciones significativamente mayores de abundancia de peces que el análisis anterior. (2)Este modelo también se compara con el enfoque del medio efectivo, ampliamente usado en problemas de dispersión acústica. La comparación teórica de los modelos muestra una buena concordancia cerca de la región de resonancia en la dirección posterior, donde los efectos de interferencia tienen un efecto mínimo.También se observa una buena concordancia en la dispersión de retorno para frecuencias bajas, donde la longitud de onda λ ≥ 4s, y s es la separación media entre vecinos más cercanos. La comparación con datos de baja frecuencia resulta igualmente buena para la dispersión posterior, mientras que en la dirección de retorno el método del medio efectivo diverge fuertemente para λ < 4s. (3) Se propone una solución en el dominio del tiempo para calcular la respuesta al impulso de una nube de burbujas en un medio compresible, incorporando los efectos de dispersión múltiple entre burbujas. Este método se basa en la teoría de perturbación y proporciona una solución aproximada, formulada mediante la adición de una perturbación a la descripción matemática de un problema exactamente soluble. El modelo se aplicó con éxito a las mediciones experimentales de una nube artificial de burbujas en un entorno de agua dulce de poca profundidad
Optimal HPL extraction and adsorption isotherms on agarose of polyphenols of maqui (Aristotelia Chilensis [Mol.] Stuntz) leaves
(2021) Rivera Tovar, Pamela Raquel; Pérez C., José Ricardo; Mariotti Celis, M. Salomé; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
En los últimos años, la producción de procesados de maqui ha aumentado drásticamente, debido a sus atractivas propiedades bioactivas. Varios estudios han posicionado el maqui entre las fuentes naturales con mayor contenido de polifenoles (compuestos altamente antioxidantes) totales. Sin embargo, debido a la compleja distribución de las bayas en la planta, la industria del maqui extrae una cantidad significativa de hojas durante la cosecha, las cuales son descartadas. Las hojas de maqui son también una rica fuente de polifenoles, incluso con mayores niveles (~51%) que las bayas. Los extractos de hoja de maqui han demostrado en estudios in vitro poseer efectos antidiabéticos y anti-hemolíticos, y en estudios in vivo, efectos antiinflamatorios y analgésicos. A pesar de estos resultados atractivos acerca de los extractos de hojas de maqui, solo se han empleado métodos convencionales de extracción de bajo rendimiento, tampoco se ha optimizado el proceso de extracción, ni se han estudiado procesos de purificación para la recuperación de extractos polifenólicos desde este descarte agroindustrial. Por lo tanto, las dos hipótesis que guiaron esta investigación fueron: (i) la aplicación de la optimización de respuesta múltiple a la extracción con líquidos calientes presurizados permite determinar las condiciones de operación que producen extractos de polifenoles con características sobresalientes desde hojas de maqui, y (ii) el estudio detallado del equilibrio de adsorción de cinco polifenoles de hojas de maqui en agarosa permite caracterizar el sistema y generar información relevante para el aislamiento de estos polifenoles mediante la cromatografía líquida preparativa de adsorción. La metodología empleada en esta tesis implica los siguientes pasos: (i) el ajuste de las respuestas (contenido total de polifenoles, capacidad antioxidante y pureza polifenólica del extracto) a superficies de primer y segundo orden y posteriormente la maximización de funciones de deseabilidad global, (ii) la caracterización de tres extractos óptimos en términos de capacidad antioxidante (mediante diferentes reacciones) y perfil polifenólico, (iii) la evaluación de los efectos composición de la fase líquida y temperatura sobre el equilibrio de adsorción de cada polifenol, y (iv) la estimación de parámetros de equilibrio isotérmico y termodinámico para cada uno de los escenarios evaluados. Los resultados de esta tesis permitirán la valorización de las hojas de maqui, que actualmente son un descarte agroindustrial, para producir ingredientes funcionales con características polifenólicas atractivas para la industria alimentaria. Además, los resultados de adsorción permitirán el diseño, la optimización y el escalamiento eficientes y precisos de la cromatografía líquida preparativa de adsorción para el aislamiento de cinco polifenoles desde extractos naturales.
Phenotype based discovery of selected oxidoreductases for the utilization of renewable resources
(2021) Chánique Sallusti, Andrea Magdalena; Parra, Loreto; Kourist, Robert; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El descubrimiento de nuevos biocatalizadores que se adapten a diversas condiciones de proceso es fundamental para implementar la biocatálisis a nivel industrial. Una técnica valiosa para buscar nuevas enzimas es el descubrimiento basado en el fenotipo, en el que las características que se encuentran en el hábitat de un organismo se utilizan como un indicador de la presencia de enzimas que funcionan en esas condiciones. El mismo razonamiento puede ser utilizado al encontrar un producto de interés en el ambiente: probablemente los organismos que viven allí producen enzimas capaces de sintetizar y degradar estos compuestos. Posteriormente, se pueden aplicar técnicas de ingeniería de proteínas a las nuevas enzimas y mejorar más aún sus características. En este trabajo, se utilizó el descubrimiento basado en fenotipo para identificar nuevas oxidorreductasas con características de relevancia industrial. La investigación se centró en encontrar nuevos miembros de dos familias: monooxigenasas de Bayer-Villiger (BVMO) y borneol deshidrogenasas de cadena corta (BDH). En el caso de BVMO, la búsqueda en el genoma de microorganismos antárticos condujo al descubrimiento de una monooxigenasa activa en frío. La enzima muestra una temperatura óptima de 20°C, presenta un 70% de su actividad óptima a 5°C y tiene una buena tolerancia a solventes orgánicos. La enzima muestra promiscuidad de cofactor y cataliza la monooxigenación de sustratos como norcamphor y biciclo[3.2.0]hept-2-en-6-ona de manera regio y enantioselectiva. En el caso de la familia de BDH, se realizó una búsqueda en el genoma de plantas que contienen un alto porcentaje de borneol o alcanfor en sus aceites esenciales, lo que condujo al descubrimiento de enzimas capaces de catalizar la oxidación de borneol de forma enantioespecífica. Algunas de estas enzimas también catalizan la reducción de alcanfor de manera diastereoselectiva. La determinación de las estructuras tridimensionales de dos de estas enzimas permitió estudiar los determinantes estructurales de la especificidad y selectividad. Se utilizó comparación de secuencias, comparación de estructuras, acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida para dilucidar la influencia de los residuos del sitio activo en estas características. También se utilizó reconstrucción de secuencias ancestrales para estudiar la historia evolutiva de esta familia en términos de especificidad y termoestabilidad. Esto llevó a la caracterización de ancestros con una especificidad moderada, en contraste con las enzimas existentes, que presentan una especificidad muy alta (E>200) o baja.

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