3.06 Facultad de Ciencias Biológicas

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Análisis in vitro de los diferentes modos de unión a ADN de los factores de transcripción MarA y Rob
(2021) Geoffroy Jarpa, Consuelo Ignacia; Melo Ledermann, Francisco Javier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El proceso de reconocimiento molecular entre proteínas y ADN es fundamental para la vida. MarA y Rob son 2 factores de transcripción de Escherichia coli pertenecientes a la familia AraC/XylS, cuyos miembros presentan una alta similitud de secuencia y se encuentran relacionados a la regulación de genes involucrados en resistencia a antibióticos, tolerancia estrés oxidativo y resistencia a disolventes orgánicos y metales pesados [1]. La estructura de ambas proteínas incluye un dominio de reconocimiento a ADN organizado en un motivo HTH bipartito, con dos hélices clave en el reconocimiento de secuencias (Hélices 3 y 6). Adicionalmente Rob presenta un dominio regulatorio en el extremo C-terminal, cuya función aún no es bien conocida. Estudios cristalográficos previos, sugieren que ambos factores de transcripción reconocen y se unen a sus secuencias promotoras de forma distinta. Mientras que MarA interactúa con dos secuencias nucleotídicas clave denominadas cajas A y B de la región promotora y une ambas hélices al surco mayor del ADN deformándolo, Rob reconoce ambas cajas, pero tan solo se une a una de ellas sin alterar la estructura nucleica. En este estudio se abordan diferentes interrogantes y se combinan e integran datos experimentales, estadísticos y computacionales lo que permite comprender los mecanismos de reconocimiento y las diferencias planteadas. El factor de transcripción purificado se agregó in vitro a los distintos promotores degenerados y las secuencias unidas y no unidas se separaron. La estrategia general fue crear una biblioteca de sitios de unión potenciales, a partir de las secuencias unidas. Ambos extremos de las secuencias de la biblioteca tienen sitios de unión de partidores de modo que pudieron amplificarse mediante PCR y ser secuenciados mediante secuenciación masiva. Por otro lado los promotores degenerados abarcaron tanto el promotor mar como el promotor micF completo y se fueron cubriendo regiones de 4 nucleótidos. Esto permitió tener una mirada global de los factores que juegan un rol importante en el reconocimiento específico proteína-ADN. Los resultados claves de este estudio son: en primer lugar que la presencia o ausencia del dominio regulatorio, jugaría un rol en la especificidad del reconocimiento proteína-ADN. En segundo lugar, la región espaciadora no aportaría especificidad a la unión, pero sí jugaría un papel clave en cuanto a la estabilidad de la unión. Y finalmente se concluye que Rob presenta dos modos de unión alternativos en donde presenta contacto directo con el surco mayor del ADN a través de la hélice 3 y la hélice 6 o bien interactúa principalmente sólo con caja A a través de hélice 3.
Antecedentes de la invasión de la especie exótica Lycalopex griseus (Zorro Gris o Chilla) en Isla Grande de Tierra del Fuego, Chile
(2021) Zurita Redón, Carlos Nicolás Felipe; Jaksic Andrade, Fabián; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Se realiza una recopilación bibliográfica de los datos sobre la invasión de Lycalopex griseus (Zorro Gris) en la Isla Grande de Tierra del Fuego con el objetivo de describir y analizar los antecedentes publicados sobre la introducción, invasión y efectos de Lycalopex griseus en dicho lugar. Se sabe que este cánido fue introducido en la Isla en 1951 de manera voluntaria para ejercer un control biológico sobre las poblaciones de Conejo Europeo (Oryctolagus cuniculus) que, a esa fecha, se estimaban sobre 30 millones de individuos. Este lagomorfo vio disminuida sus abundancias poblacionales a raíz de la introducción de la enfermedad viral mixomatosis que provocaba su muerte, en tanto que el Zorro Gris comenzó a aumentar sus abundancias sin haber ejercido eficazmente su rol putativo de controlador biológico. Para esto, se hace una revisión con ayuda de Google Académico y algunos criterios de búsqueda para encontrar literatura al respecto. Se evidencia que esta es escasa, y aporta datos antiguos que requieren actualización. Entre los datos recopilados, destacan antecedentes sobre su nicho trófico, donde se muestra que este cánido incorpora ítems dietarios diversos, como vegetales y micromamíferos; además, datos sobre sus poblaciones que muestran los sectores de la isla donde con mayor probabilidad de avistamiento de Zorros Grises. En conclusión, se hacen necesarios nuevos esfuerzos de muestreo para actualizar la información y resolver otras incógnitas que han sido planteadas en la literatura por años, como la eficacia y eficiencia de los zorros como controladores biológicos de conejos.
Associations between habitat conditions, sociality, and brain organization in octodontid rodents.
(2014) Sobrero Inverardi, Raúl Eduardo; Ebensperger Pesce, Luis Alberto; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Nuestro conocimiento sobre la evolución del comportamiento social en roedores octodóntidos es aún fragmentario. La información disponible indica que las especies filogenéticamente basales son solitarias, mientras que las más derivadas tienden a ser sociales. Sin embargo, la información sobre la estructura social disponible para varias especies es anecdótica, lo cual dificulta el establecimiento de conclusiones robustas sobre la evolución del comportamiento social en este clado. Este es el primer estudio que cuantifica la actividad, uso del espacio, y comportamiento social del degú costino (Octodon lunatus), una especie derivada de octodóntido. Durante noviembre y diciembre de 2010 y 2011 se utilizaron métodos de captura-recaptura y telemetría para cuantificar el patrón diario de actividad superficial, ámbitos de hogar, solapamientos entre ámbitos de hogar, y uso compartido de parches de descanso y nidificación en una población costera localizada en el centro-norte de Chile.La actividad de O. lunatus, medida como desplazamientos individuales entre localizaciones consecutivas, mostró una tendencia estadísticamente no significativa a ser mayor en horas de la noche. Durante el día los animales usaron 1 a 3 sitios de descanso y anidamiento asociados con una alta cobertura arbustiva, donde Pouteria splendens (lúcumo) fue la especie dominante. Machos y hembras compartieron estos sitios de descanso en múltiples ocasiones. El solapamiento entre los ámbitos de hogar tendió a ser mayor en animales que además compartieron sitios de descanso comparado con animales que no compartieron estos sitios. En base al uso compartido de refugios se identificó 1 grupo social en 2010 y 4 grupos en 2011. La composición de estos grupos fue de 1 a 3 hembras adultas y de 1 a 2 machos adultos (2 a 4 adultos en total). Globalmente, los resultados indicaron que O. lunatus muestra algún grado de sociabilidad, observación que apoya una tendencia en la cual el comportamiento social es más frecuente en especies filogenéticamente derivadas de octodóntidos.
Astrocytes from the retrotrapezoid nucleus drives chemoreceptor neuron hyper-responsiveness to hypercapnia in heart failure: role of oxidative stress and glutamate spill-over
(2024) Díaz Jara, Esteban; Río Troncoso, Rodrigo Andre del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La insuficiencia cardiaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una enfermedad crónica caracterizada por una alta prevalencia de desórdenes respiratorios e irregularidades en el patrón ventilatorio, las cuales están estrechamente asociados con la potenciación del quimiorreflejo central. El principal núcleo quimiorreceptor central es el núcleo retrotrapezoide (RTN), ubicado en la superficie del tronco encefálico, que contiene neuronas que frente a un estímulo hipercápnico propagan potenciales de acción excitatorios hacia los centros respiratorios, modulando el patrón respiratorio. En modelos preclínicos de ICFEP, la eliminación selectiva de las neuronas quimiorreceptoras del RTN normaliza la quimiorrefleja central y elimina la irregularidad en el patrón respiratorio. Sin embargo, los mecanismos celulares que potencian la función del RTN durante la ICFEP no se han estudiado previamente. En los últimos años, se ha demostrado que, además de las neuronas quimiorreceptoras, los astrocitos ubicados en el RTN desempeñan un papel clave en la regulación de la quimiorrecepción en condiciones normales. Sin embargo, se desconoce el rol de estas células en el control de la quimiorecepción central durante la ICFEP. Por lo tanto, propuse como hipótesis que "El estrés oxidativo aumenta el impulso del quimioreflejo central en la ICFEP al reducir la captación de glutamato mediada por los astrocitos en el núcleo retrotrapezoide". Los objetivos principales de esta tesis doctoral fueron: i) Determinar los niveles de estrés oxidativo y glutamato en el RTN y estudiar la contribución del estrés oxidativo en las respuestas exageradas del quimiorreflejo central en ratas con ICFEP; ii) Determinar las alteraciones en la morfología de los astrocitos y la localización y expresión del transportador de glutamato-1 (GLT-1) en el RTN de ratas con ICFEP; iii) Determinar la actividad neuronal en secciones del tronco encefálico que contienen el RTN de ratas con ICFEP; y iv) Determinar si la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de ratas con ICFEP restaura la respuesta normal de las neuronas quimiorreceptoras a la hipercapnia. La ICFEP fue inducida en ratas Sprague Dawley machos adultos (~250 g) mediante una fístula arteriovenosa. Se utilizó pletismografía de cuerpo entero para evaluar tanto la respuesta ventilatoria a la hipercapnia (FiCO2 7%), como el patrón respiratorio en reposo. Los niveles del anión superóxido y de superóxido dismutasa 2 en el RTN se determinaron por tinción con dihidroetidio (DHE) y Western Blot, respectivamente. La morfología de los astrocitos y los niveles de GLT-1 en el RTN se determinaron mediante inmunofluorescencia y RNAscope, respectivamente. La localización celular de SOD2 y de GLT-1 se realizó mediante análisis bioinformáticos. Los niveles de glutamato extracelular en el RTN se midieron en animales anestesiados, y posteriormente mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para evaluar la actividad de las neuronas quimiorreceptoras RTN, se realizaron inyecciones estereotáxicas de un adenovirus que permitió la expresión de un sensor de calcio citoplasmático (GCaMP6s) en las neuronas. Posteriormente se analizaron los cambios de fluorescencia en las secciones del tronco encefálico que contenían el RTN mediante microscopía confocal. Finalmente, la sobreexpresión de GLT-1 en astrocitos RTN fue realizada por la inyección estereotáxica de un adenovirus que permitió la expresión del transportador de glutamato-1 bajo el promotor específico de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los animales con ICFEP presentaron un aumento en los niveles del anión superóxido en el RTN, los cuales están estrechamente relacionados con la potenciación del quimiorreflejo central en animales ICFEP. El aumento de los niveles de superóxido en el RTN se asoció con la disminución en los niveles de expresión de SOD2, tanto a nivel de mRNA y proteína, en los animales con ICFEP. En paralelo, animales con una disminución parcial de SOD2 presentan un aumento en los niveles de superóxido en el RTN los cuales se correlacionan con la potenciación del quimiorreflejo central, similar a lo observado en animales con ICFEP. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que SOD2 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN en lugar de en las neuronas quimiorreceptoras. Las ratas con ICFEP presentan un aumento en los niveles de glutamato extracelular en el RTN tanto en condiciones basales como durante el estímulo hipercápnico comparado con animales Sham. Tanto las ratas con ICFEP como en animales con una disminución parcial de SOD2 presentan una disminución en la morfología de los astrocitos del RTN. Interesantemente se observó que los animales con ICFEP presentan una disminución en la tinción de NMB, el marcador de neuronas quimiorreceptoras del RTN. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que GLT-1 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN y no en las neuronas quimiorreceptoras, y que en los animales con ICFEP, existe una disminución en los niveles de GLT-1 en el RTN. Las neuronas quimiorreceptoras del RTN de animales con ICFEP presentan un aumento de actividad tanto en condiciones basales como al ser expuestas a un medio ácido. Finalmente, la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de animales con ICFEP normaliza la actividad de las neuronas quimiorreceptoras del RTN. Además, la sobreexpresión de GLT-1 normaliza los niveles extracelulares de glutamato en el RTN, el quimiorreflejo central y el patrón respiratorio en animales con ICFEP. Estos resultados sugieren que el aumento del estrés oxidativo y la disfunción de los astrocitos en el RTN juegan un rol clave en la potenciación del quimiorreflejo y en la progresión de la ICFEP, principalmente a través la recaptación del glutamato extracelular.
B3 transcription factors regulate iron distribution in A. thaliana embryos
(2021) Grant Grant, Susana Margarita; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El hierro es un macronutriente esencial para todos los seres vivos. En humanos, la deficiencia de hierro en la dieta es la principal causa de anemia en el mundo. La Organización Mundial de la Salud a propuesto la biofortificación de cultivos como una alternativa para aumenta el contenido de hierro en los alimentos. Uno de los cultivos más consumidos en la dieta humana son las semillas. Sin embargo, poco se conoce sobre la acumulación del hierro en semillas. En Arabidopsis thaliana durante la maduración del embrión el hierro se acumula en las vacuolas de la capa celular que rodea la provasculatura. En A. thaliana y otras plantas modelo se han identificado tres factores de transcripción B3, FUS3 (FUSCA3), LEC2 (LEAFY COTYLEDON2) y ABI3 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3), que cumplen una función crítica en la acumulación de compuestos de almacenaje como proteínas y lípidos en la semilla durante la maduración. La función de los factores de transcripción B3 en la maduración y la acumulación de compuestos de almacenaje ha sido bien estudiaba, sin embargo, la función de estos factores de transcripción B3 en la acumulación de micronutrientes como el hierro no ha sido estudiada. En este trabajo se estudió el rol de los factores de transcripción B3 en la homeostasis de hierro en semillas de A. thaliana, utilizando mutantes para los factores de transcripción B3 y técnicas histológicas y de biología molecular. En este trabajo se determinó que los factores de transcripción B3 participan en la regulación de la distribución de hierro en semillas de A. thaliana, pero no así el contenido total de hierro en semilla. Los resultados de este trabajo mostraron que los genes asociados a la homeostasis de hierro cambiaron su expresión en las semillas mutantes para los factores de transcripción B3. Este cambio en la expresión coincide con el fenotipo heterocrónico de las semillas mutantes en los genes de los factores de transcripción B3. Finalmente, a través de una Red de Regulación Génica se encontró un nuevo rol para la vía de respuesta a etileno asociado a la distribución de hierro en semillas. Estos resultados entregan algunas respuestas sobre la regulación de la homeostasis de hierro en semillas, a pesar de que aún quedan muchas preguntas sin respuesta, como, por ejemplo: ¿Cómo el etileno regularía la distribución de hierro en semillas? y ¿Qué factores de transcripción regulan directamente a los genes asociados a la homeostasis de hierro?
Biogeografía histórica reciente de los vertebrados del "Hotspot" de Chile mediterráneo: dinámicas de distribución y nicho climático de linajes intraespecíficos, desde el último máximo glacial hasta el presente
(2015) Gutiérrez Tapia, Pablo Andrés; Palma Vásquez, Ramón Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Biodiversity losses under the species level (i.e. cryptic diversity) may have been severely undersestimated in future global climate change scenarios. Therefore, it’s important to characterize diversity units at this level, and also understand its ecological responses to climatic forcings. We have chosen an endemic rodent from a highly endangered area as a model to look for cryptic distributional responses below the species level: Phyllotis darwini in the central Chile biodiversity hotspot. This area harbors a high amount of endemic species, and it’s known to have experienced vegetational displacements between two mountain systems during and after the Last Glacial Maximum. We’ve implemented an approach which integrates phylogeographic information into species distribution models. Our major findings are that the species is compossed of two major phylogroups: one of them has a broad distribution mainly accros valley but also in mountain ranges, meanwhile the other displays a disjunct distribution across both mountain ranges and always above a 1500 m altitude limit. Lineage distribution model under LGM climatic conditions sugget that both lineages were codistributed in the southern portion of P. darwini’s current geographic range, and mainly at the valley and coast. We’ve concluded that present distribution of lineages in P. darwini is the consequence of this cryptic distributional response to climate change after LGM, with a postglacial colonization with strict altitudinal segregation of both phylogroups.
BZIP transcription factors and transcriptional regulatory networks in the neurospora circadian system
(2014) Montenegro Montero, Alejandro Esteban; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Circadian clocks are endogenous cellular timekeepers that confer daily rhythms to a large number of biological processes. These clocks are present in various organisms across different evolutionary lineages, in which they regulate close to 24-hours rhythms in gene expression, physiology and behavior, enabling individuals to anticipate predictable environmental variations. The ascomycete Neurospora crassa has played a key role in the unveiling of the molecular and genetic basis of these time-telling machineries. In Neurospora, as in other eukaryotes, the integration of a series of cellular and molecular processes gives rise to a robust cell-based pacemaker, capable of coordinating rhythmic control of several aspects of their biology. Although a detailed molecular description of the core oscillator or pacemaker is now possible in model eukaryotes, there is limited information on the mechanisms that allow it to regulate rhythmic processes. Such “output pathways”, the circuits through which the pacemaker endows different processes with rhythmicity, are the least characterized aspect of circadian systems. In Neurospora, a hierarchical arrangement of transcriptional regulators has been proposed as the main mechanism through which the clock regulates rhythmic gene expression.The different actors involved in such time relay, connecting the oscillator with overt rhythms, are however largely unknown. In addition, despite decades as a research model organism, little is known about transcriptional regulatory networks in this fungus and the vast majority of transcription factors in Neurospora remain uncharacterized. In an effort to improve current knowledge of output pathways, the most neglected aspect of circadian biology, in a clock model system and study transcriptional regulatory networks in a model eukaryote, we set out to characterize the bZIP family of transcriptional regulators in Neurospora, in the context of its circadian system. We report a complete revision of the list of sequence-specific DNA-binding proteins in this fungus, which resulted in the identification of several novel ones, including many bZIP proteins. As the few transcription factors that have been associated with output pathways in Neurospora have been shown to exhibit clock input, we evaluated whether the expression of bZIP encoding genes in this organism is under control of the circadian clock. By using a luciferase-based, high-throughput screening system, we identified several bZIP encoding genes whose expression is regulated by the circadian pacemaker. A major limitation in the study of transcriptional regulatory networks in Neurospora, such as those underlying clock regulated transcription, stems from the fact that little is known about the sequence preference of its transcription factors. With the goal of identifying and characterizing transcriptional regulatory networks in which the putative Neurospora transcription factors participate, we employed double-stranded DNA microarrays known as protein-binding microarrays, to determine the sequence preference of Neurospora transcription factors.Such an approach allows for rapid, high-throughput and unbiased characterization of the sequence specificity of DNA-binding proteins. This resulted in the determination of the sequence preference of over half of Neurospora predicted transcription factors, information that together with the various molecular tools available in Neurospora, led to the identification of a rhythmically expressed bZIP transcription factor, ADA-1, as a regulator of output pathways in Neurospora, controlling various output genes. In addition, this information allowed for the evaluation of the role of another bZIP transcription factor, ASL-1, in such pathways. Notably, this is the first report aimed at studying DNA-binding specificities on a global scale in the fungal kingdom outside of the yeast clade, representing a powerful resource for the study of transcriptional regulatory networks in filamentous fungi, the largest group within the fungal kingdom. Indeed, through the use of these data we identified, for the first time, a transcription factor that is required for growth under osmotic stress in Neurospora. Lastly, we report on the identification of a novel process involved in output pathways in Neurospora, namely cell fusion pathways, and we herein show it to be necessary for proper rhythms in a number of genes, including bZIP encoding genes. As a whole, the work reported in this Thesis, represents a major advancement in the study of bZIP proteins and transcriptional regulatory networks in Neurospora.
Calcifying phytoplankton in natural laboratories for understanding ocean acidification
(2021) Díaz Rosas, Francisco Javier; Dassow, Peter von; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los cocolitofóridos son organismos fitoplanctónicos unicelulares caracterizados por una cobertura de placas de calcita, los cocolitos, que son producidos dentro de la célula. Estos calcificadores, como uno de los principales grupos funcionales planctónicos, juegan un rol importante en el ciclo del carbono inorgánico y posiblemente como lastre hundiendo carbono orgánico hacia el océano profundo. La mayoría de los esfuerzos para entender las respuestas de los cocolitofóridos hacia la acidificación del océano (AO) –o el aumento del CO2 atmosférico reduce el pH y estado de saturación (Ω) de CaCO3 del océano– ha sido a través de experimentos de laboratorio, principalmente usando un pequeño set de cepas de la especie más cosmopolita y fácilmente cultivable Emiliania huxleyi. Esta especie resulta particularmente interesante ya que es joven (~ 291.000 años) y se ha adaptado a un amplio rango de ambientes marinos. Sin embargo, este no es el único cocolitofórido y aun dentro de esta especie hay mucha diversidad fenotípica y genética y respuestas diversas hacia la AO en el laboratorio. A pesar de los esfuerzos realizados aun no es claro como los efectos fisiológicos bajo condiciones controladas se trasladan a respuestas de campo a nivel de comunidad. Esta tesis buscó contribuir a entender este asunto estudiando la distribución, composición y nicho realizado de ensambles de cocolitofóridos y morfotipos de E. huxleyi en ambientes con niveles contrastantes de pCO2/pH/Ωcalcita del Pacífico Sureste, y evaluar las respuestas de diferentes morfotipos de E. huxleyi a niveles de pCO2/pH ajustados en el laboratorio. Para esto, se muestrearon los cocolitofóridos en una sección costera-oceánica, aguas mesotróficas, sistemas de surgencia, y fiordos-canales de Patagonia. De un total de 40 especies, E. huxleyi fue la más prevalente (30-100 % abundancia relativa). Dentro de este taxón, varios morfotipos han sido descritos como estables en cultivo y diferenciados genéticamente (e.g., los morfotipos A y R). El morfotipo A moderadamente-calcificado dominó las poblaciones de E. huxleyi siendo sólo superado por el morfotipo R altamente-calcificado en sistemas de surgencia con alto pCO2/bajo pH. Este cambio abrupto en composición de las poblaciones de E. huxleyi sugirió que estos ambientes costeros mantienen reservorios genéticos para su adaptación a la AO. Por consiguiente, se probó la hipótesis que aquellas formas están adaptados para resistir condiciones de alto pCO2/bajo pH. Inesperadamente, los morfotipos del Pacífico Sureste no fueron más sensibles que las cepas altamente-calcificadas desde aguas contiguas con alto pCO2/bajo pH (disminuyeron las tasas de crecimiento y razón PIC/POC). Por otro lado, análisis de nicho realizado mostraron que el morfotipo A posee un nicho más amplio y tolerante a cambios ambientales (i.e., generalista) que el nicho del morfotipo R, especializado en aguas con alto pCO2/bajo pH. La falta de evidencia de adaptación local a condiciones de alto pCO2/bajo pH en E. huxleyi, podría ser explicado por una estrecha respuesta unimodal hacia Ωcalcita revelado por el análisis de nicho que no fue testeado experimentalmente. Alternativamente, el morfotipo R altamente-calcificado podría ser seleccionado por una condición particular del Pacífico Sureste no identificada que se correlaciona con temperatura, salinidad y Ωcalcita de su nicho realizado. En suma, a pesar de poseer rápidas tasas de reemplazo y grandes tamaños poblacionales, organismos planctónicos oceánicos no necesariamente exhiben adaptaciones a la surgencia de aguas con alto CO2, y este ubicuo cocolitofórido podría estar cerca del límite de su capacidad para adaptar a la AO en curso.
Caracterización biomecánica del proceso de NETosis en suspensión
(2022) Morales Camilo, Nicole; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las NETs son fibras de cromatina descondensada que forman una red compuesta mayoritariamente por ADN e histonas y proteínas antimicrobiales, consecuencia del mecanismo de muerte celular programada llamada NETosis, para la generación de una barrera física que previene la diseminación de patógenos. La NETosis es un proceso dinámico que implica transformaciones significativas en el citoesqueleto y el núcleo celular, y con ello, cambios significativos en las propiedades mecánicas celulares; sin embargo, la caracterización de este proceso en un contexto cercano al fisiológico no ha sido abordado. Este trabajo busca estudiar la biomecánica del proceso de NETosis en suspensión utilizando una aproximación interdisciplinaria. Para medir los cambios morforeológicos del proceso de NETosis en flujo se adaptó la metodología de RT-DC y determinó el módulo de Young (elasticidad) de los neutrófilos estimulados. El RT-DC corroboró que la NETosis inducida por PMA es independiente al proceso de adhesión, en condiciones de flujo. Así también, el análisis de los gráficos área versus deformación obtenidos por el RT-DC, permitió la clasificación y caracterización de subpoblaciones celulares, y comprobar la generación de NETs en suspensión. Finalmente, la caracterización morforeológica de estos neutrófilos muestran un aumento significativo en su tamaño celular (>30 µm2) y cambios de elasticidad con una fase inicial “rápida” de aumento en la rigidez y luego una fase “lenta” de disminución de la rigidez. Este estudio proporcionó evidencia necesaria para relacionar las características biomecánicas de la NETosis con el mecanismo molecular y la temporalidad descrita para este proceso, en un contexto cercano al fisiológico.
Caracterización de la regulación transcripcional y función del gen SDH2-3 de Arabidopsis thaliana.
(2013) Restovic Carvajal, Franko; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Our group has undertaken the study of mitochondrial function in plants focusing on complex II (succinate dehydrogenase, SDH) of Arabidopsis thaliana. This complex plays a pivotal role in the tricarboxylic acid (TCA) cycle and the electron transport chain, two fundamental processes in the energetic plant metabolism. We have described the existence of three nuclear genes coding for iron-sulfur proteins (SDH2), named SDH2-1, SDH2-2 and SDH2-3. Two of them, SDH2-1 and SDH2-2, are almost identical (96%) and share the same exon-intron structure. SDH2-3 on the other hand, has a different exonintron structure and has approximately 70% identity to the other two. Additionally, unlike SDH2-1 and SDH2-2 that are expressed in adult plants, SDH2-3 expression is confined to seed maturation and it decreases during germination, while SDH2-1 and SDH2-2 transcripts are low in seeds and they begin to accumulate after germination and during vegetative growth. We have described seed-specific cis-elements necessary for promoter activity (three ABA-responsive elements or ABRE and one RY element) and determined in vitro binding of seed-specific transcription factors to them (bZIP10, bZIP25 and bZIP53 binding to ABREs; ABI3 and FUS3 binding to RY). Moreover, we have determined that ABI3 and FUS3 are necessary for promoter activity in planta, as mutant lines of these factors showed decreased SDH2-3 levels in seeds. On the other hand, we have determined that SDH2-3 is important for seed germination, indicating a specific role during this developmental stage. The main focus of this thesis work is to study the seed-specific expression and the function of SDH2-3. It is worth noting that no reports of mitochondrial proteins bearing this singular expression pattern have been published. Therefore, we will determine essential regions of the SDH2-3 promoter and additional putative cis-elements controlling transcriptional regulation, transcription factors involved, and the function of this protein during seed maturation and postgerminative growth. Regarding the SDH2-3 promoter, during this thesis we were able to determine a minimal region necessary and sufficient for promoter activity, between -114 and +49 from the transcription start site. Moreover, the 5´UTR region (+1 to +49) is essential for SDH2-3 promoter activity, as determined by loss-of-function experiments. In addition, transient expression assays showed that ABI3 is able to activate SDH2- 3 transcription in vivo alone or in combination with bZIP factors bZIP10, bZIP25 or bZIP53. However, single bZIP factors were unable to activate the promoter, and only transfection with bZIP10 and bZIP53 was able to induce expression. Moreover, SDH2-3 transcript levels are significantly reduced in bzip53 mutant dry seeds. These results indicate the SDH2-3 promoter is activated by bZIP transcription factors and corroborate the importance of ABI3. On the other hand, we determined that SDH2-3 influences seed development and maturation, as lack of this protein resulted in decreased seed weight. Interestingly, protein content also showed a reduction in sdh2-3 mutants while lipid content did not show any biologically significant variation. This is an interesting feature since seed metabolism is directed during maturation towards the formation of seed proteins and lipids. Thus, the decrease in protein content would explain the lower total weight. Although it has been suggested that mitochondria plays a minor role during seed maturation, these results suggest that its role should be reconsidered, as it may carry out important metabolic tasks during this stage. Mitochondrial role during postgerminative growth is well characterized. Here we show that sdh2-3 mutants have impaired hypocotyl growth in the dark. Moreover, TTFA treatment (complex II inhibitor) abolishes hypocotyl growth and seedling establishment. All these results suggest an essential role for complex II during postgerminative growth and establishment. Wild seeds in nature generally germinate underground, in conditions where they lack direct sunlight. A seed with a non-functional SDH2-3 would be in disadvantage over wild-type seeds, which would elongate their hypocotyls further until they reach light in order to promote photoautotrophic growth. SDH2-3 gives an important advantage to the plant in energy-consuming processes such as germination and early stages towards seedling establishment. This work shows the importance that this nonessential gene can have in critical stages of plant development. The existence of a SDH2-3-like gene in the moss Physcomitrella patens has drawn our attention because SDH2-3 has been described as a seed-specific expressed gene in angiosperms, and mosses do not have seeds. We confirmed the SDH2-3-like gene is expressed and increases under osmotic stress, in contrast to saline stress, desiccation and high ABA content. Moreover, we determined that Physcomitrella SDH2-3 promoter lacks significant activity in Arabidopsis, either in seeds or vegetative tissue. These results indicate that the transcriptional regulation of this gene in Physcomitrella evolved in an independent way as compared to Arabidopsis.
Caracterización de los genes MIT1 y MIT2 de Arabidopsis Thaliana que codifican para transportadores mitocondriales de hierro
(2021) Vargas Pérez, Joaquín Ignacio; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Entre los micronutrientes esenciales para las plantas, el hierro es aquel que se requiere en mayor abundancia ya que es componente de cofactores como hemo y centros hierro azufre, que participan en procesos como la fotosíntesis y la respiración, entre otros. Importantes avances han permitido conocer los mecanismos que rigen la homeostasis del hierro a nivel fisiológico en las plantas, sin embargo a nivel subcelular existen aún muchas interrogantes. En este contexto, las mitocondrias son organelos con un alto requerimiento de hierro ya que albergan parte de la ruta de síntesis de centros hierro azufre y utilizan numerosos cofactores de hierro en la cadena transportadora de electrones, que en total suman al menos 9 hemos y 13 centros hierro azufre, por lo que la función mitocondrial y el metabolismo del hierro se encuentran estrechamente relacionados. Se ha estudiado poco la homeostasis del hierro mitocondrial en plantas y poco se sabe de los transportadores involucrados. Recientemente fue descrito el primer transportador de hierro mitocondrial en plantas, llamado Mitochondrial Iron Transporter (MIT) en Oryza sativa y codificado por un gen esencial. En base a este transportador identificamos dos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, At1g07030 (MIT1) y At2g30160 (MIT2). La expresión de estos genes en levaduras mutantes en los transportadores mitocondriales de hierro de alta afinidad les permite a estas levaduras crecer en medio deficiente en hierro, lo que sugiere fuertemente que MIT1 y MIT2 transportan hierro a la mitocondria en levaduras. Para caracterizar la función de MIT1 y MIT2 se obtuvieron 3 líneas homocigotas mutantes para MIT1 y 2 líneas homocigotas mutantes para MIT2, y ninguna de ellas presentó alteraciones en su fenotipo. Además la segregación del alelo mutado en la descendencia de plantas heterocigotas tampoco mostró alteraciones. Estos resultados sugieren que ambos genes son redundantes, lo que fue confirmado al cruzar líneas mutantes nulas mit1 y mit2 y no poder obtenerse dobles homocigotas mutantes. Este resultado demostró además que la función MIT es esencial en Arabidopsis. Al cruzar una mutante nula de MIT2 y una “knockdown” de MIT1 fue posible obtener plantas dobles homocigotas mutantes que en la primera generación expresaban un 10-20 % de MIT1. Estas plantas resultaron ser viables y presentaron múltiples alteraciones fenotípicas: embriones con tres cotiledones, retraso en la germinación, en el crecimiento post-germinativo y durante todo el desarrollo. Además, se encontraron anormalidades morfológicas en semillas, hojas, flores y tallos. Parte de estas alteraciones podría explicarse directamente por una disfunción mitocondrial generada por deficiencia de hierro en el organelo, lo que se sustenta en la inducción de genes marcadores de respuesta a perturbación/estrés mitocondrial. Otra parte de las alteraciones podría estar relacionada con un efecto indirecto de la perturbación mitocondrial sobre la homeostasis de auxina. El análisis de los datos transcriptómicos revela que estas plantas tienen probablemente reprimida la adquisición de hierro, la síntesis de cumarinas, la formación de la banda de Caspari, la suberización y el desarrollo de los pelos radiculares. Y tienen aumentada la expresión de genes relacionados con desarrollo y mantención de meristemas, formación y límites de órganos, desarrollo de flores. Curiosamente estas plantas dobles homocigotas mutantes recuperaron un fenotipo normal en la siguiente generación, lo que se correlaciona con un aumento de la expresión de MIT1 (70% a nivel de transcrito y 30% a nivel de proteína, respecto de plantas silvestres), probablemente debido al mecanismo descrito de “supresión de T-DNAs intrónicos”. Estas plantas “compensadas” no son diferentes de plantas silvestres en actividad mitocondrial, en el proteoma mitocondrial y en el transcriptoma.
Characterization of bacterial heme oxygenase ChuS of probiotic strain E. coli Nissle 1917 and its potential therapeutic uses.
(2020) Coronado Arrázola, Irenice; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.
Characterization of OPA1 disease-related mutations and their effect on mitochondrial fusion dynamics, cristae organization and calcium homeostasis
(2020) Cartes Saavedra, Benjamín Tomás; Eisner Sagüés, Verónica Raquel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La fusión de la membrana interna mitocondrial y la forma de las crestas mitocondriales son dependientes de la proteína OPA1. Mutaciones en el gen de OPA1 provocan una enfermedad llamada Atrofia Óptica Autosómica Dominante (ADOA), la cual es una de las principales causas de ceguera hereditaria. Los dominios GTPasa y el dominio effector de la actividad GTPasa (GED) son esenciales para el papel de OPA1 en su actidiad de fusión, sin embargo, el papel específico que cumple cada dominio en las funciones de OPA1 aun son aún desconocidos. Interesantemente, pacientes con mutaciones en el domino GTPasa tienen un mayor riesgo de desarrollar síntomas multisistémicos. En este estudio, se analizaron mutaciones de OPA1 en los dominios GTPasa y GED para entender la contribución de cada dominio a la función de la proteína, mediante experimentos con células de pacientes con ADOA or experimentos de ganancia de función en líneas celulares. Las mutantes de OPA1 en el dominio GTPasa y GED mostraron alteraciones diferenciales en la ultraestrcutrua mitocondrial. Además, la presencia de todas las mutantes inhibieron la actividad de fusión de las mitocondrias, sin embargo, algunas mutantes del dominio GTPasa presentaron una red mitocondrial hiperelongada. En este trabajo encontramos que el dominio GED es crucial para una actividad GTPasa adecuada. Sin embargo, el dominio GED, a diferencia del dominio GTPasa, no es requerido para mediar la fusión de las mitocondrias. Además, pesar de que el GED es un dominio de interacción con proteínas, este no sería necesario para formar oligomeros de OPA1. Finalmente, estudiamos el papel de OPA1 y sus dominios en la homeostasis del calcio intracelular, encontrando que la proteína, a través de su dominio GED, cumple un papel importante en la transferencia del calcio desde el Retículo Endoplásmico hacia la mitocondria. En resumen, las mutantes dominio-específicas de OPA1 muestran caracteríticas y funciones diferentes en la ultraestrcutura mitocondrial, acitidad de fusión de las mitocondrias y homeostasis del calcio intracelular, pudiendo ser éstas funciones clave en la severidad y progresión de la enfermedad de ADOA.
Characterization of the Enterobacteriaceae-associated ROD21-like family of excisable genomic islands and study of excision in the pathogenicity island ROD21
(2021) Piña Iturbe, Luis Alejandro; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las islas genómicas (IGs) son elementos adquiridos horizontalmente que juegan un papel importante en la evolución del genoma y la adaptación bacteriana a diferentes ambientes, ya que estos elementos transfieren genes que codifican diferentes funciones ventajosas para la bacteria, por ejemplo: la capacidad de metabolizar nuevos sustratos, la resistencia a los antimicrobianos o la virulencia, entre otras. Además de estas funciones, muchas IGs también contienen un módulo de escisión/integración que incluye los genes que codifican la maquinaria molecular (la enzima integrasa y el factor de direccionalidad de recombinación) y las regiones reguladoras necesarias que promueven una reacción de recombinación específica de sitio. Esta reacción da como resultado la escisión de la isla del cromosoma como un elemento circular que puede ser el sustrato para la transferencia por conjugación o puede reintegrarse. De manera interesante, se ha encontrado evidencia que el estado escindido/integrado de algunas IGs tiene un rol en la virulencia de las bacterias en su hospedador, aunque por ahora, este fenómeno se ha observado solamente en dos IGs. La creciente disponibilidad de genomas bacterianos secuenciados ha permitido la identificación y caracterización de varias IGs las cuales han sido clasificadas en diferentes familias que comparten un set conservado de genes implicados en los procesos de transferencia y escisión, que comparten vías reguladoras comunes. La identificación y clasificación de las IGs permite comprender mejor su evolución, sus interacciones con su hospedador y los mecanismos reguladores que rigen su transferencia a otras bacterias. Sin embargo, muchas IGs aún no han sido clasificadas y la comprensión de su biología sigue siendo limitada. La Región de Diferencia 21 (ROD21, por sus siglas en inglés) es una isla de patogenicidad escindible y movilizable que codifica algunos factores de virulencia involucrados en la infección producida por Salmonella enterica serovar Enteritidis, un patógeno transmitido por alimentos y una de las serovariedades de Salmonella de mayor prevalencia en el mundo. Los experimentos realizados con cepas mutantes de Salmonella ser. Enteritidis que tienen una capacidad reducida o alterada para escindir ROD2, mostraron un defecto en estas cepas para invadir órganos internos en el modelo murino de infección. Un resultado que puede estar relacionado con los cambios observados en la expresión de los genes en ROD21 y en otros loci genómicos. Sin embargo, aunque la escisión de ROD21 tiene un rol en la virulencia de Salmonella ser. Enteritidis, se conoce muy poco acerca de la regulación de este proceso. ROD21 también está presente en los serovares Gallinarum y Dublin, y aunque se ha reportado la existencia de “islas relacionadas con ROD21”, no se conoce más acerca de este tema. En esta Tesis Doctoral, se utilizaron diferentes herramientas bioinformáticas para identificar islas relacionadas con ROD21 y analizar su filogenia y contenido genético. Estos análisis revelaron que ROD21 pertenece a una familia de islas genómicas presentes en diferentes cepas de bacterias patógenas de plantas y animales del orden Enterobacterales, la cual fue denominada Enterobacteriaceae-associated ROD21-like (EARL). El análisis filogenético sugiere que la familia EARL se originó en bacterias patógenas de plantas y que la adquisición de genes específicos permitió su diseminación a diversos hospedadores bacterianos. Se encontró también que, si bien estas islas codifican grupos de genes variables y conservados, el módulo de escisión/integración fue la única región conservada en las 56 islas identificadas, incluida ROD21, hallazgo que destaca la naturaleza escindible de la familia EARL como se demostró para dos de sus miembros albergados por Klebsiella pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos cepa KP35 y Escherichia coli enteropatógena O127:H6 cepa E2348/69. Cabe destacar que las islas EARL poseen genes que codifican homólogos cortos y de longitud completa del regulador transcripcional global H-NS, una proteína involucrada en la regulación de funciones bacterianas importantes como la virulencia y la transferencia horizontal de genes. Como parte del módulo de integración /escisión conservado, se caracterizaron el gen SEN1998 y su producto proteico purificado para evaluar su rol en la escisión de ROD21. Si bien SEN1998 codifica un factor de direccionalidad de recombinación capaz de unirse a las regiones de ADN involucradas en el proceso de escisión, la deleción de este gen solo produjo una ligera reducción en el nivel de escisión. Sorpresivamente, los niveles de expresión de SEN1998 resultaron estar correlacionados negativamente con la escisión de ROD21, una característica que también se observó para el gen SEN1970 que codifica la integrasa. A pesar de estos hallazgos, no está claro si la represión de SEN1998 y SEN1970, la cual ocurrió inmediatamente antes que comenzara a aumentar la escisión, está relacionada a la regulación de este proceso. En resumen, los resultados de esta Tesis amplían el repertorio de islas genómicas escindibles identificadas, presenta información sobre su evolución y proporciona un primer acercamiento a la comprensión de la regulación de la escisión en la isla de patogenicidad ROD21. Estos hallazgos podrían contribuir a una mejor comprensión de los patógenos actuales y emergentes como lo son las diferentes serovariedades de Salmonella, E. coli patógena y K. pneumoniae ST258 resistente a carbapenémicos, entre otros.
Characterization of the MYB60 Gene of Phaseolus vulgaris and its Role in Regulating Stomatal Aperture
(2024) Martínez Barradas, Vera Isabel; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal
In this thesis the Phaseolus vulgaris MYB60 gene was characterized, and it is pointed as a promising candidate to improve its tolerance to drought stress. The specific objectives were: Characterize the ‘Zorzal’ cultivar physiological and yield response to drought stress in greenhouse. Identify, clone, and characterize the MYB60 gene of Phaseolus vulgaris orthologous to Arabidopsis thaliana including its coding region and promoter. Establish an in vitro regeneration protocol for the “Zorzal” common bean cultivar and design gRNAs that can be furtherly used for its edition. Zorzal presented physiological traits associated with drought tolerance. However, these traits are insufficient to maintain a stable yield under severe drought stress at the pre-flowering stage.Phaseolus vulgaris has a PvMYB60 ortholog gene to the MYB60 of Arabidopsis thaliana, with stomata-specific expression that is involved in promoting stomatal aperture.An in vitro regeneration method was developed that allows successful fertile plant regeneration of ‘Zorzal’ common bean by direct organogenesis from embryonic axis and embryonic apical meristem explants, with regeneration rates of 58.3 and 21.1% respectively, that together with the designed gRNAs provide a potential tool for genetic manipulation of Zorzal cultivar and common bean in general.
Complejidad de los efectos no letales de depredadores y su transmisión en tramas tróficas : experimentos en terreno y laboratorio con organismos intermareales.
(2013) Manzur Castillo, Tatiana; Navarrete C., Sergio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las interacciones depredador-presa han sido ampliamente reconocidas como un factor crítico en la dinámica de sistemas ecológicos, reconocimiento que se ha basado primordialmente en el aspecto letal de la depredación (i.e. cuantas presas son consumidas por el depredador). Sin embargo, en todos los sistemas naturales los depredadores también pueden afectar la demografía, distribución y evolución de las especies presa a través de los costos de las respuestas antidepredatorias desplegadas para reducir su susceptibilidad a la depredación, respuestas que se entienden como \201Cefectos no letales\201D de los depredadores (ENL). Además de influir fuertemente sobre la dinámica de las poblaciones presa, los ENL de los depredadores pueden también propagarse a través de la trama trófica como efectos indirectos mediados por rasgo (EIMR), afectando la estructura, diversidad y las dinámicas de comunidades completas. El escape activo es una de las respuestas antidepredatorias ampliamente reportadas en diversos taxa marinos. Para que un escape sea exitoso, las presas deben ser capaces de detectar y evaluar el riesgo de depredación idealmente antes de un contacto físico, utilizando señales o información provenientes del depredador o del medio ambiente. La distancia a la que una presa reacciona a la presencia de su depredador (distancia de detección), la extensión espacial y la duración de la respuesta de escape, junto con las tasas de encuentro entre depredador y presa son determinantes de la escala espacio-temporal del ENL del depredador en un sistema y de la importancia ecológica que dicho efecto tendrá a escalas o niveles de organización mayores (e.g. poblacional). No obstante, la aproximación metodológica que han empleado la mayoría de los trabajos que estudian ENL y su transmisión a otros niveles tróficos raramente ha considerado en forma explícita o implícita la escala \2018natural\2019 de las interacciones, lo que podría redundar en la problemática de extrapolar los resultados de manipulaciones experimentales a lo que ocurre efectivamente en la naturaleza. Por otro lado, la expresión de respuestas antidepredatorias supone un costo para las presas que puede manifestarse como una reducción en sobrevivencia, crecimiento o reproducción y, por lo tanto, es esperable que estas respuestas sean rápidas, flexibles (reversibles), especificas y conmensurables con el nivel de riesgo real, minimizando dichos costos. Sin embargo, pocos son los estudios que han cuantificado directamente los costos de estas respuestas y cómo estos pueden influenciar la magnitud y dirección de los efectos indirectos de los carnívoros sobre el nivel trófico basal transmitidos mediante cambios conductuales de los herbívoros. En esta tesis estudiamos los ENL de un depredador y su transmisión en tramas tróficas utilizando como sistema de estudio una trama trófica de tres niveles en el intermareal rocoso. Mediante combinación de manipulaciones experimentales en terreno y laboratorio se investigaron los ENL del depredador asteroideo Heliaster helianthus sobre rasgos de dos consumidores intermedios, el equinoideo Tetrapygus niger y el gastrópodo Fissurella limbata, así como la potencial transmisión de dichos efectos a algas (Ulva sp.) en el nivel trófico basal. El estudio evaluó la escala espacial y temporal en que ocurren estas interacciones, el efecto de estas escalas sobre la interpretación de manipulaciones experimentales, y los costos energéticos que conllevan estas respuestas para las presas. Se demostró que T. niger detecta a Heliaster a través de señales químicas difundidas en el agua hasta distancias de 50 cm y que la distancia recorrida en un escape es de alrededor de 40 cm. Es esperable entonces que el efecto del riesgo de depredación sea variable espacialmente. Manipulaciones experimentales de laboratorio demostraron que las respuestas dependen fuertemente del tiempo de exposición al riesgo y del tamaño del acuario en que se realizan las manipulaciones. Aunque se observaron algunos cambios de corto plazo en el forrajeo de los erizos en presencia de Heliaster, no se evidenció transmisión del ENL sobre Ulva sp. Finalmente, se demostró que en presencia del depredador, F. limbata aumentó rápidamente el consumo de oxígeno, las tasas de movimiento y las distancias recorridas, pero al contrario de muchos estudios anteriores en otros sistemas, F. limbata tendió a aumentar su actividad de forrajeo. En conjunto, los resultados sugieren que la respuesta antidepredatoria de esta presa es energéticamente costosa y que podría compensarse con un mayor consumo de algas. En general, mi estudio ilustra la importancia de cuantificar las escalas espacio-temporales de los ENL y la complejidad de cuantificar su transmisión a otros niveles tróficos en manipulaciones experimentales.
Considering local knowledge in adaptive capacity of local communities at the land-sea interface
(2023) Barceló Carvajal, Matías Paulo; Gelcich, Stefan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Globally, coastal communities are facing changes and threats to biodiversity and food security. A major driver of change relates to declining productivity of fisheries and agriculture in coastal areas that depend on land and sea. Terrestrial and marine ecosystems provide diverse benefits to people through ecosystem services, such as food supply, coastal protection, climate regulation and cultural experiences. Since land-sea interactions can negatively affect the livelihoods of communities, it is important to understand how this interaction affects different ecosystem services at the land-sea interface and, consequently, human well-being. One way that coastal communities cope with these changes is through their adaptive capacity, i.e., their ability to respond to and anticipate change. An important indicator of adaptive capacity is local knowledge, which can help to cope with environmental threats that negatively affect natural resources. The objectives of this thesis are i) to identify approaches, tools and knowledge gaps on the study of land-sea interactions in their relationship with ecosystem services; ii) to assess the relationship between local knowledge, values and livelihoods to identify emerging synergies or trade-offs in this relationship; and iii) to assess how different dimensions of adaptive capacity, including local knowledge, determine the adaptive capacity of coastal communities. For the first objective, a systematic literature review of publications was conducted through Web of Science, using keywords on land-sea interaction. For objectives two and three, we conducted semi-structured interviews in local communities in the Valdivian coast, southern Chile. We assessed local knowledge, values and livelihoods. In addition, we assessed dimensions of adaptive capacity such as agency, social capital, institutions, local knowledge and assets, to determine their role in past and hypothetical future responses to resource depletion scenarios. The systematic review identified 166 publications. The results indicate that the main disciplines that have investigated land-sea interactions were biogeochemistry and ecology, with a focus on nutrients. Regarding ecosystem services, supporting and regulating services were the most investigated, with urbanization and agricultural and forestry effluents as the main topics of study. On the other hand, we highlight the low number of studies that include management strategies and social components in land-sea interaction. Regarding the second objective, the results show heterogeneity in the relationship between values and livelihoods: there are communities that may lose knowledge and values when they expand their livelihoods and communities that do not. Certain types of livelihood diversification strategies may result in constraints that can affect knowledge transmission and differences in the type of values. Finally, the results of objective three show the critical role of local knowledge in adaptive capacity in past and future responses to hazards that may affect resource-dependent local communities. These results highlight the importance of including local knowledge in an adaptive capacity framework. Our results demonstrate the knowledge gaps that exist at the land-sea interface and the importance of beginning to understand the role of local knowledge in the adaptive capacity of coastal communities in order to improve resource management practices at the land-sea interface and move towards more sustainable futures.
Control of motivation for palatable food by kappa opioid receptor signaling and the neuropeptide Orexin-A
(2023) Sandoval Caballero, Carolina Loreto; Pérez Leighton, Claudio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Eating is a motivated behavior that provides nutrients to allow life. Animals evolved to perceive food as a positive reinforcer, resulting in increased motivation for food when the animal is hungry and decreased motivation when it is satiated. Motivation evolved to seek and eat food in an environment of food scarcity; however, it can become maladaptive in an environment with plenty food access, favoring excessive eating, weight gain, and obesity. Understanding the neuronal mechanisms regulating food motivation could improve therapies against obesity.Opioids and the hypothalamic Orexin/Dynorphin neurons are part of the brain mechanisms that regulate food intake and motivation for food. Opioids bind mainly to three G-protein coupled receptors (kappa, mu, and delta), which are expressed in brain regions that regulate food intake and motivation. Still, the contribution of each opioid receptor to food intake and motivation for food is unclear. The Orexin/Dynorphin neurons co-release the excitatory neuropeptides Orexins (e.g., Orexin-A and Orexin-B) and the inhibitory opioids Dynorphin (e.g., Dynorphin-A 1-13) into different areas, including the Oxytocin neurons from the paraventricular hypothalamic nucleus. The effects of Orexin and Dynorphin peptides in eating behavior are brain-site specific. For example, in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 increases and Orexin-A decreases palatable food intake (i.e., tasty food, generally high in sugars and fats). Still, the opposite effect is observed in the ventral tegmental area. Dynorphin-A1-13 binds mainly to the kappa opioid receptor, which is expressed in the anorexigenic oxytocin neurons of the paraventricular hypothalamic nucleus; however, whether inhibition of oxytocin neurons is involved in the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 in the paraventricular hypothalamic nucleus is unknown. Also, in this brain region, Orexin-A blocks the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13. Still, it is unclear whether these effects are mediated by changes in motivation for palatable food and whether the endogenous kappa opioid receptor signaling in the paraventricular hypothalamic nucleus regulates motivation for food. We hypothesize that in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 signaling through the kappa opioid receptor promotes motivation for sucrose, and Orexin-A inhibits this behavior. We evaluated this hypothesis through four specific aims. [1] To determine through a meta-analysis the effects of kappa, mu, and delta opioid receptor ligands on food intake and motivation. We found that: (1) agonists increased food intake after central injections while antagonists decreased food intake after central and peripheral injections. (2) We did not find differences between the effects of opioid receptor ligands on standard rodent food intake after injections in the paraventricular hypothalamic nucleus compared to other brain sites. (3) Mu agonists had the strongest orexigenic effect compared to kappa and delta agonists, with the most significant effect on fat intake. (4) Whereas only centrally administered kappa antagonists reduce feeding, peripherally administered antagonists for all opioid receptor subtypes reduce feeding; (5) peripheral administration of antagonists decreases motivation for food regardless of food type. [2] To determine whether in the paraventricular hypothalamic nucleus signaling through kappa opioid receptor mediates the ability of Dynorphin-A1-13 to increase motivation for sucrose. We assessed motivation for sucrose using a progressive ratio schedule in which mice must perform work licks to obtain sucrose. After each sucrose reward obtention, there was a 20 sec time-out period in which licks were recorded, but sucrose could not be obtained. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to the vehicle: (1) bilateral administration of the kappa opioid antagonist nor-binaltorphimine increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work and time-out licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. These effects were also found after subcutaneous administration of nor-binaltorphimine. (2) Unilateral Dynorphin-A1-13 administration increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing time-out licks. (3) Bilateral Dynorphin-A1-13 administration did not change the time to obtain sucrose rewards. However, it strongly decreased sucrose work licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. Also, nor-binaltorphimine did not block Dynorphin-A1-13 effects. Finally, we could not downregulate the expression of the kappa opioid receptor in the paraventricular hypothalamic nucleus and thus, these effects in motivation for sucrose were not performed. [3] To determine whether oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus express the kappa opioid receptor and whether blocking the kappa opioid receptor activates Oxytocin neurons in this brain region. Published data demonstrated that the kappa opioid receptor is expressed in oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus. Thus, we assessed whether nor-binaltorphimine activates oxytocin neurons and decreases food intake in mice. We found that nor-binaltorphimine administration in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased cafeteria diet intake and abolished the negative correlation between the percentage of active caudal oxytocin neurons and cafeteria diet intake established after vehicle injection. [4] To determine whether activation of the kappa opioid receptor by Dynorphin-A1-13 and orexin receptors by Orexin-A in the paraventricular hypothalamic nucleus have opposing effects on motivation for sucrose. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to vehicle (1) Unilateral Orexin-A administration increased sucrose work and time-out licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing the time to obtain sucrose rewards and time-out licks. (2) Orexin-A decreases the demotivational effects of Dynorphin-A1-13.We conclude that signaling through orexin and opioid receptors modulates feeding behaviors and motivation for food. Those effects depend on variables including the dose and administration route of the drug, food tested, and circadian period in which the outcomes were measured. Dynorphin-A1-13 and nor-binaltorphimine in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased sucrose work licks, and Orexin-A blocked the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 over time. We reasoned that the demotivational effects of nor-binaltorphimine could involve the activation of anorexigenic oxytocin neurons, and the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 could be explained by their signaling through other receptors besides the kappa opioid receptor, such as Mu opioid receptor. We conclude that during the active phase of the mice, Orexin-A potentiates the orexigenic mechanisms that are naturally active in mice and increases locomotion and motivation. Consequently, the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 could not be detected because orexigenic mechanisms reached a ceiling effect. Thus, instead of promoting motivation for sucrose, Dynorphin-A1-13 prompts allodynia that decreases feeding and motivated behaviors.
Coupling cell communication and optogenetics: implementation of a light-inducible intercellular system in yeast
(2023) Rojas Jorquera, Vicente Alberto; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La comunicación celular es un fenómeno extendido en biología, permitiendo la transmisión de información acerca de las condiciones del entorno. Con el fin de entender cómo la comunicación celular modula procesos biológicos relevantes, diferentes sistemas sintéticos basados en inducción química han sido exitosamente desarrollados. En este trabajo, se acopló la comunicación celular y la optogenética en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La aproximación consiste en dos poblaciones conectadas por la producción dependiente de luz de la feromona factor-α en un tipo celular, que induce la expresión génica en el otro grupo de células. Después de la caracterización individual de tres variantes de ambas cepas, el sistema intercelular optogenético fue evaluado combinando las diferentes células bajo condiciones contrastantes de iluminación. Usando luciferasa como gen reportero, co-cultivos específicos a una proporción 1:1 muestran activación de la respuesta bajo luz azul constante, lo que no fue observado para las mismas mezclas crecidas en oscuridad. Entonces, el sistema fue evaluado en varias transiciones oscuridad/luz azul, donde el nivel de respuesta varia dependiendo del momento en el que la iluminación fue entregada. Además, la amplitud de la respuesta puede ser ajustada modificando la proporción inicial entre ambos tipos de cepa. También, células expresando todas las partes del circuito sintético se generaron para verificar si la separación de actividades biológicas mejora el rendimiento general del sistema. En ese contexto, el sistema de dos poblaciones mostró mayores veces de inducción en comparación con cepas autónomas. Esta exitosa implementación del sistema intercelular optogenético abrió la oportunidad de expandir el repertorio de las cepas de levadura involucradas variando componentes de la vía de señalización como reguladores negativos y promotores de respuesta a feromona. Así, se obtuvieron diversas versiones del sistema, que muestran un amplio rango de niveles de respuesta bajo regímenes de inducción por luz. En general, estos resultados demuestran que la información externa de la luz es propagada a través de una molécula de señalización difusible para modular la expresión génica en un sistema sintético de células microbianas, lo que pavimentará el camino para estudios que permitan el control optogenético de dinámicas a nivel de población.
Derivando relaciones evolutivas entre las proteínas de cubierta de membrana mediante comparaciones estructurales
(2021) Gutiérrez Espinosa, Fernando Ignacio; Melo Ledermann, Francisco Javier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las proteínas de cubierta de membranas (MC) cumplen un rol esencial en el transporte intracelular, permitiendo el intercambio de materiales entre los compartimientos especializados dentro de las células eucariotas. Las proteínas MC poseen una combinación única de dominios β-propeller/α-solenoide que les otorga la capacidad de deformar membranas. Su arquitectura y las señales de secuencia señalan que estas proteínas probablemente evolucionaron a partir de un ancestro común, pero la gran divergencia estructural lleva a sugerir que estas proteínas han cambiado considerablemente durante la evolución. Esto constituye un reto sobre todo para determinar relaciones evolutivas usando las herramientas disponibles basadas en comparación de secuencias y estructuras producto de la extrema divergencia observada entre estas proteínas. Actualmente no existe un claro consenso acerca de los diferentes tipos de arquitectura que existen entre las proteínas de cubierta de membranas y, en el estado del arte, solamente se han generado árboles filogenéticos cualitativos según las relaciones parciales encontradas entre sus miembros sin considerar comparaciones estructurales a gran escala de manera exhaustiva. Por ello, en el desarrollo de esta tesis se creó una nueva herramienta computacional para la comparación flexible de estructura de proteínas llamada MOMA2, que permite evaluar las similitudes estructurales entre proteínas muy divergentes mediante matrices de elementos de estructuras secundarias que nos permiten capturar la topología de las proteínas. Este programa ha sido diseñado para capturar las similitudes estructurales entre proteínas distantes mediante comparaciones estructurales flexibles, permitiéndonos clasificarlas según sus dominios y visualizar también el desplazamiento de cuerpo rígido de los sub-fragmentos encontrados equivalentes. Por ende, hemos utilizado esta herramienta para generar un nuevo esquema de clasificación de las proteínas de cubierta de membrana basado en la similitud estructural de sus dominios, permitiéndonos a la vez, construir árboles filogenéticos basados en comparaciones estructurales que confirman las relaciones conocidas, además permiten extender aquellas relaciones ya existentes y finalmente descubrir nuevas relaciones entre sus miembros. Por último, esta herramienta ha permitido reformular un modelo parsimonioso considerando las posibles combinaciones de dominios que pudieron dar origen a los diferentes arreglos de dominios que están presentes en las proteínas MC. En síntesis, el desarrollo de esta nueva herramienta nos ha permitido específicamente plantear los posibles pasos que dieron origen a las proteínas de cubierta de membrana a partir de las comparaciones de estructurales a pesar de la extrema divergencia que poseen estas proteínas. Por otro lado, desde una visión más general, esta herramienta nos abre nuevas posibilidades para explorar relaciones que aún permanecen ocultas debido a la extrema divergencia que poseen sus secuencias, pero que aún conservan sus similitudes estructurales.

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