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    An adenine insertion in exon 6 of human GP6 generates a truncated protein associated with a bleeding disorder in four Chilean families
    (2013) Matus Ritter, Valeria; Valenzuela, G.; Sáez S., Claudia; Hidalgo, P.; Lagos Lucero, Marcela; Aranda Lauriani, Eduardo Javier; Panes Becerra, Olga Teresa; Pereira Garcés, Jaime Ignacio; Pillois, X.; Nurden, A.; Mezzano, Diego
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    Changes in regional cerebral blood flow are associated with endothelial dysfunction markers in cocaine-dependent patients under recent abstinence
    (2015) Massardo, T.; Quintana Fresno, Juan Carlos; Jaimovich, Rodrigo; Sáez S., Claudia; Cabreras, M.J.; Pereira-Flores, K.; Ibanez, C.; Pallavicini, J.; Veliz, J.; Mezzano, Diego; Pereira Garcés, Jaime Ignacio
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    Estudio de marcadores de disfunción endotelial en el síndrome metabólico : evaluación de la vía RhoA/ROCK como posible eje de señalización
    (2015) Leguina Ruzzi, Alberto Andrés; Sáez S., Claudia; Velarde Aliaga, María Victoria; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
    El Síndrome Metabólico (SM) es un agregado de condiciones cardio-metabólicas que en cronicidad involucra patologías tales como la obesidad, diabetes e hipertensión arterial (HTA), aumentando considerablemente el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares (ECV). La aterosclerosis es el denominador común de las patologías que desencadenan los eventos cardiovasculares y la disfunción endotelial (DE) es la alteración base del proceso aterosclerótico. La prevalencia mundial del SM ha aumentado progresivamente, alcanzando alrededor del 25% de la población adulta. Existen datos clínicos de una población mas joven que califica para SM por mostrar un aumento de la circunferencia de la cintura y sobrepeso junto con niveles elevados de triglicéridos plasmáticos. En este grupo de sujetos jóvenes con SM se desconoce la presencia de marcadores de daño endotelial e inflamatorios similares a los que presentan pacientes adultos sobre 50 años con diabetes tipo 2 e hipertensión. En este último grupo de adultos, se han reportado niveles elevados de citoquinas inflamatorias tales como IL-6, de ácidos grasos, específicamente el ácido palmítico (AP), hiper-insulinemia y alteraciones relacionadas con DE y, solo en un reporte, se ha mencionado la sobre-activación de la vía RhoA/ROCK.En base a lo expuesto planteamos como hipótesis que: IL-6, insulina y AP son moléculas que se encuentran elevadas en sujetos con SM sin diabetes tipo 2 o hipertensión arterial, y pueden inducir DE mediada por la activación de RhoA/ROCK. Para poner a prueba nuestro postulado propusimos tres estrategias que involucran estudios ex–vivo, in–vitro e in–vivo. Los estudios ex–vivo se realizaron en sujetos adultos jóvenes que consultaron por sobrepeso pero calificaron para SM por presentar aumento del contorno de cintura y dislipidemia. Nuestros resultados mostraron que el grupo de sujetos evaluado tiene, además de niveles de LDL-c elevados y HDL-c bajos, altos niveles de IL-6, insulina y AP, aumento de marcadores de DE tales como MCP-1, sICAM-1, aumento de marcadores de estrés oxidativo (AOPP y TBARS), menor biodisponibilidad de óxido nítrico (ON) y una sobre activación de RhoA/ROCK en leucocitos en comparación a sujetos sanos. Aunque dentro de rango normales, se encontró además, mayores niveles plasmáticos de ácido úrico, menores niveles creatinina y un moderado estado de hiper-coagulabilidad en comparación con individuos controles.El estudio in-vitro se llevó a cabo en células endoteliales de cordón umbilical estimuladas con concentración similares a las encontradas en sujetos con SM de IL-6, insulina y AP, con el objetivo de evaluar la participación de RhoA/ROCK en el daño endotelial inducido por estas moléculas. Los resultados mostraron que la combinación de IL-6, insulina y AP activa la vía RhoA/ROCK y altera la señalización de Akt y ERK. Adicionalmente, se reducen los niveles de ON y la actividad de eNOS, junto a un aumento de los niveles de marcadores de estrés oxidativo. Se observaron cambios en la estructura de actina y de VEcaderina y alteraciones en la citoarquitectura de la monocapa celular, acompañado de un aumento de la actividad de MMP9 intracelular. La triple estimulación aumentó la adhesión plaquetaria, la actividad pro-coagulante, la liberación de Factor de Von Willenbrand (FVW), MCP-1, siCAM-1, E-selectina y la acumulación intracelular de lípidos. Todas estas alteraciones a excepción de los niveles de FVW y la actividad pro-coagulante parecen ser mediadas por la sobre-activación de RhoA/ROCK ya que se evitaron al adicionar el inhibidor Y-27632.La participación de RhoA/ROCK en relación a características de SM se evaluó en un modelo de ratas alimentadas con una dieta rica en AP por 14 semanas con y sin la administración de Fasudil, un inhibidor de RhoA/ROCK, por las dos últimas semanas. Los resultados muestran que la dieta alta en grasa indujo características SM tales como: sobrepeso, mayor circunferencia abdominal y dislipidemia. A las 14 semanas de dieta los animales tuvieron presión sistólica elevada, altos niveles de triglicéridos, colesterol y glicemia, en comparación a los animales controles pero dentro de los rangos de normalidad. La dieta alta en grasa indujo además altos niveles de insulina, IL-6, aumento de tejido adiposo extra-peritoneal, marcadores de estrés oxidativo (TBARS y AOPP), siCAM-1, sCD40L, ácido úrico y niveles reducidos de ON. La administración de Fasudil por dos semanas, revirtió las alteraciones observadas. El análisis de las aortas de los animales alimentados con dieta rica en AP muestra una mayor infiltración grasa y un aumento de la actividad de RhoA/ROCK, de E-selectina, una disminución de la actividad de Akt, eNOS y de los niveles de Nrf2 comparados con las aortas de los animales alimentados con dieta control. Los animales tratados con Fasudil mostraron una reducción de las alteraciones mencionadas. A pesar de la presencia de alteraciones metabólicas, la dieta alta en grasa no indujo diabetes ni HTA en los animales durante el periodo estudiado.Consideramos que los resultados de esta tesis entregan evidencias sobre la participación de RhoA/ROCK en las alteraciones relacionadas a la DE asociadas a SM y demuestra el rol del AP, IL-6 e insulina como componentes que, al estar elevados en pacientes con SM, promueven DE. Adicionalmente, creemos que los resultados obtenidos entregan información relevante para sujetos jóvenes con SM que, por no mostrar síntomas relacionadas con patologías tales como diabetes tipo 2 o hipertensión, desconocen que ya presentan signos relacionados con mayor riesgo cardiovascular.
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    Increased RhoA/Rho-Kinase Activity and Markers of Endothelial Dysfunction in Young Adult Subjects with Metabolic Syndrome
    (2015) Leguina-Ruzzi, Alberto; Pereira Garcés, Jaime Ignacio; Pereira-Flores, Karla; Valderas Igor, Juan Patricio; Mezzano, Diego; Velarde Aliaga, María Victoria; Sáez S., Claudia
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    Participación de la vía mTOR y leptina sobre la programación funcional en monocitos de hijos de madres con obesidad pregestacional
    (2020) Vega Tapia, Fabián Alejandro; Krause Leyton, Bernardo; Sáez S., Claudia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
    Los hijos de mujeres con obesidad pregestacional (HMO) presentan un riesgo elevado de desarrollar obesidad y enfermedades crónicas asociadas a lo largo de la vida. En obesos adultos, incluyendo a mujeres embarazadas, existe una inflamación crónica de bajo grado mediada por niveles elevados de citoquinas y adipoquinas proinflamatorias, que se inicia a nivel de tejido adiposo blanco y que evoluciona hacia una inflamación sistémica persistente. Dicho estado de inflamación continuo induce la disfunción de diversos órganos, lo que favorece el desarrollo de enfermedades de alto riesgo. El estado inflamatorio en adultos obesos favorece la polarización M1 (i.e. proinflamatoria) en monocitos y macrófagos, en contraposición a la polarización M2 (i.e. antiinflamatoria). Estudios incipientes, de nuestro equipo y otros, muestran que cultivos in vitro de monocitos y macrófagos de HMO presentan una polarización M1/M2 alterada, sugiriendo una programación fetal del sistema inmune inducida por el estado nutricional de la madre. Si bien no existe evidencia convincente de que los HMO presenten cambios en su estado inflamatorio mediado por citoquinas al nacer, se ha reportado en reiteradas ocasiones niveles elevados de leptina, una adipoquina con efectos proinflamatorios, que se eleva en contextos de obesidad gestacional, tanto en sangre materna como fetal. Adicionalmente, se ha reportado, en adultos, que las señales metabólicas son integradas en las células inmunes, en parte por la activación de la vía del complejo proteico blanco de la rapamicina de mamíferos (mTOR). Dicho complejo considera dos isoformas, mTORC1 y mTORC2, cuya activación se ha asociado a respuestas M1 y M2, respectivamente. Sin embargo, se desconocen si mediadores inmuno-metabólicos, como Leptina y mTOR, contribuyen a las alteraciones funcionales de monocitos de HMO observadas al nacer. En resumen, diversos elementos podrían contribuir a las alteraciones funcionales observadas en macrófagos y sus precursores, los monocitos, de HMO, entre los cuales los altos niveles de leptina, mTOR y la metilación del DNA en la programación funcional temprana pueden jugar un rol preponderante en la programación de estas células. Esta tesis propone que la obesidad pregestacional resulta en cambios en metilación de genes de la vía mTOR en monocitos fetales, la que se relaciona con la expresión de mediadores pro-M1 y una activación predominante de mTORC1 en un contexto de niveles elevados de leptina. Para responder esta propuesta se caracterizó el perfil epigenómico y el estado de la activación de la vía mTOR, así como su relación con una programación funcional M1/M2 en monocitos de HMO. Además, se estudió el efecto de la exposición prolongada a leptina, y el rol de los complejos mTORC1 y mTORC2, sobre la programación funcional M1/M2 en las líneas celulares de monocitos. Los resultados obtenidos muestran la existencia de cambios en los niveles de metilación del DNA en sitios de genes M1 y M2, así como genes vía leptina-mTOR en hijas de mujeres con obesidad pregestacional, pero no en sus hijos. Diversos sitios diferencialmente metilados están involucrados en la regulación transcripcionales de sus respectivos genes. Por otra parte, la diferenciación de monocitos a macrófagos en presencia de leptina potencia un patrón de expresión proinflamatorios en monocitos de hijos de mujeres normopeso, y recapitula las respuestas in vitro de monocitos de HMO. En conclusión, los presentes resultados permiten sugerir que la obesidad materna programa, mediante cambios epigenéticos, la vía leptina-mTOR, lo que favorecería el desarrollo de un fenotipo proinflamatorio mediado por esta hormona en hijas de mujeres con obesidad.
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    Vernix caseosa como potencial tratamiento tópico para la dermatitis atópica: estudio comparativo in vitro con tratamientos farmacológicos tópicos convencionales
    (2023) Cabalín Arenas, Carolina Andrea; Borzutzky Schachter, Arturo; Sáez S., Claudia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Medicina
    La dermatitis atópica es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel frecuentemente asociada a infecciones por Staphylococcus aureus. Su patogénesis implica alteraciones en la barrera epidérmica, inmunidad innata, alteraciones en la expresión génica, entre otros. Varios de los genes asociados a mediadores de la respuesta proinflamatoria en la etiopatogenia de la dermatitis atópica están bajo el control de factores de transcripción pertenecientes a la familia del factor nuclear (NF)-kB. Por otro lado, los factores pertenecientes a la familia del factor de transcripción de receptores X del hígado (LXR) que antagonizan la respuesta de NF-kB se asocian con respuestas antiinflamatorias en pacientes con dermatitis atópica, pero no está claro cuáles de los genes más alterados en la piel lesional y no lesional son potencialmente modulados por LXR que antagonizan la respuesta de NF-kB. Los tratamientos tópicos convencionales como hidrocortisona, tacrolimus y ácido fusídico, son eficaces, pero presentan limitaciones, efectos secundarios y no causan remisión de la dermatitis atópica en todos los pacientes, generando una carga económica y emocional significativa. Por esto, se busca desarrollar nuevas opciones terapéuticas con mejores resultados. La vernix caseosa, una biopelícula proteolipídica presente en la piel de recién nacidos, tiene propiedades con alto potencial para la remisión de la dermatitis atópica, como hidratación, fortalecimiento de la barrera epidérmica y propiedades antimicrobianas. Estudiar los efectos de la vernix caseosa en modelos in vitro de dermatitis atópica infectados por S. aureus, así como identificar posibles mecanismos brindaría evidencia preclínica para un nuevo tratamiento para la dermatitis atópica. Así, la hipótesis de esta tesis es “la vernix caseosa disminuye la carga bacteriana de S. aureus y mejora las alteraciones en la inmunidad de la barrera epidérmica en dermatitis atópica comparativamente mejor que los tratamientos tópicos convencionales, mediante la activación de las vías asociadas a LXR e inhibición simultánea de la señalización por NF-kB”. El objetivo general fue “evaluar comparativamente el efecto de la vernix caseosa y de tratamientos tópicos convencionales sobre la carga bacteriana de Staphylococcus aureus, biomarcadores de inmunidad cutánea en dermatitis atópica y cambios en la expresión transcripcional de genes potencialmente modulados por LXR y NF-kB en modelos in vitro de dermatitis atópica”. Primero, se determinó qué genes presentan alteraciones transcripcionales asociadas a las vías moduladas por los factores LXR y NF-B en piel lesional y no lesional con dermatitis atópica mediante un meta-análisis; entre los que 46 genes están sobre-expresados y 20 genes sub-expresados en piel lesional, mientras que 2 genes se encontraban sobre-expresados y ninguno sub-expresado en piel no lesional. De estos genes, un 46% se encuentra potencialmente modulado por LXR, un 35% está potencialmente modulado por NF-kB y un 56% está potencialmente modulado por ambas vías, mostrando un potencial involucramiento de los factores nucleares LXR y NF-kB en la patogénesis de la dermatitis atópica. Posteriormente, como prueba de concepto, se estableció que el tratamiento tópico del agonista de LXR VTP-38543, a través de un sub-estudio del ensayo clínico aleatorizado controlado VITAE, no genera cambios en la activación de la sub-unidad p65 de NF-kB, proteínas estructurales de membrana (zonula occludens, claudina 1, involucrina), células de Langerhans (CD207), reacción alérgica mediado por mastocitos (triptasa) y reacción reguladora (Linfocitos T reguladores, FoxP3); sugiriendo la necesidad de que un nuevo tratamiento apunte a modular LXR y NF-kB simultáneamente. Luego de caracterizar la vernix, se determinó por primera vez la presencia de proteínas de barrera epidérmica, como loricrina y claudina 1, así como inmunoglobulinas (IgE e IgA) y mediadores de las respuestas inmunes Th2 y Th22. También se describió carga bacteriana de S. epidermidis, S. hominis y S. aureus en la vernix. Posteriormente, se demostró in vitro que la vernix caseosa tiene actividad antibiótica comparable con ácido fusídico de forma directa contra S. aureus y en el modelo 2D de dermatitis atópica inducida in vitro, lo que demuestra su actividad anti-S. aureus. A su vez, la vernix caseosa disminuye la pérdida de agua de forma comparable a hidrocortisona y aumenta la resistencia eléctrica de igual forma que los tratamientos tópicos convencionales, sugiriendo una mejora de la integridad de la barrera epidérmica de forma comparable con los tratamientos tópicos convencionales en modelos 2D de dermatitis atópica. Además, sólo la vernix caseosa reduce la secreción de nitritos en el modelo 2D de dermatitis atópica inducida in vitro, mientras que los tratamientos tópicos convencionales no cambian la secreción de éstos; sugiriendo una reducción de inflamación general de forma más efectiva que los tratamientos tópicos convencionales. En el modelo 3D de dermatitis atópica inducida in vitro se observó que la vernix caseosa tiene mayor capacidad de aumentar la resistencia eléctrica, demostrando que ésta es más eficiente en lograr la recuperación de la integridad de la barrera epidérmica que los tratamientos tópicos convencionales. Además, la vernix aumenta la secreción de RNasa 7, lactoferrina e interleucina 33, mientras que los tratamientos tópicos convencionales no cambian las secreción de estos mediadores; demostrando la capacidad de la vernix para promover la respuesta antimicrobiana y anti-inflamatoria cutánea. La vernix caseosa podría modular la reducción de expresión relativa de ARNm de S100A8 (calgranulina A), el aumento de PI3, loricrina y B-defensina 2 vía activación de LXR; mientras que el aumento de RNAsa 7 vía inhibición de NF-kB. Así, se determinó que los beneficios de la vernix caseosa podrían estar mediados por la activación anti-inflamatoria de LXR y la inhibición pro-inflamatoria de NF-kB, pero se requieren estudios adicionales para confirmarlo. Estos resultados proporcionan evidencia preclínica para trasladar a los compuestos bioactivos de la vernix caseosa a estudios clínicos como un nuevo tratamiento alternativo para la dermatitis atópica. Se espera que este enfoque proporcione una solución más efectiva y con menos efectos secundarios para los pacientes, mejorando su calidad de vida y reduciendo la carga de la enfermedad en el sistema de salud.