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Análisis bioinformático y modelación matemática de un consorcio microbiano infantil bajo el consumo de oligosacáridos de leche materna
(2023) Proschle Donoso, Tomás Alonso; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
La microbiota intestinal infantil desempeña un papel crucial en la salud y el desarrollo durante la primera infancia. La colonización temprana por bacterias beneficiosas en el tracto gastrointestinal contribuye a la maduración del sistema inmunológico, la digestión eficiente de nutrientes y la prevención de trastornos metabólicos. La alimentación con leche materna durante los primeros 6 meses de vida proporciona al infante nutrientes esenciales y azúcares complejos como los oligosacáridos de leche materna (HMOs), que actúan como prebióticos selectivos para microorganismos beneficiosos. El género Bifidobacterium se destaca por ser uno de los principales grupos capaces de degradar HMOs y representa más del 70% de la comunidad microbiana intestinal durante la lactancia. Dentro del intestino del infante existe una comunidad bacteriana compleja, lo que plantea la interrogante de cómo se desarrollan las relaciones ecológicas entre estos microorganismos. Este estudio se centró en caracterizar las interacciones clave entre las especies que componen un consorcio microbiano artificial, formado por siete bacterias relevantes de la microbiota infantil. Utilizando la metodología leave-one-out para cultivos in vitro de la comunidad propuesta, cultivados en lactosa y HMOs representativos, se llevaron a cabo análisis multivariables y análisis metatranscriptómicos. Además, se desarrolló un modelo matemático que permitió determinar la dinámica de degradación y consumo de azúcares complejos a nivel de comunidad. Se observó una dominación por parte de Bifidobacterium bifidum, sustentado por análisis funcionales de los consorcios. También, se encontró una disminución significativa en la degradación de HMOs en su ausencia, evidenciable en el modelo matemático planteado. La presencia de Bifidobacterium bifidum redujo significativamente la presencia de Bifidobacterium infantis, lo que evidenció una competencia directa entre estas especies. La eliminación de Escherichia coli del consorcio provocó una activación transcripcional generalizada de las demás especies, lo cual también se observó en los análisis multivariables. Se sugiere que para investigaciones futuras se utilice la metodología de análisis de redes de co-expresión génica ponderada (WGCNA) para identificar correlaciones entre módulos funcionales de genes presentes en los experimentos.
Bi-directional cultures reveal metabolic cross-feeding between gut commensals
(2021) Hirmas Olivares, Belén Alejandra; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
La microbiota intestinal humana se define por miles de interacciones, algunas caracterizadas por cross-feeding o intercambio de subproductos metabólicos. La inulina y el xilano son polisacáridos de la dieta que son fermentados por redes microbianas en el intestino grueso. La fermentación de estos resulta en diferentes perfiles de ácidos grasos de cadena corta, los cuales son beneficiosos para el huésped. En este trabajo se estudió las interacciones metabólicas entre dos microorganismos comensales del intestino, Phocaeicola dorei y Lachnoclostridium symbiosum, al usar inulina o xilano como fuente de carbono. Se hipotetiza que existen interacciones de cross-feeding entre ambas bacterias, donde P. dorei actúa como consumidor primario de carbohidratos complejos y produce metabolitos que pueden ser consumidos por L. symbiosum para producir butirato. El ensayo bidireccional mostró que L. symbiosum alcanza mayor crecimiento en presencia de P. dorei, mientras que el ensayo unidireccional mostró que es necesaria una interacción simultánea para que ocurra esta relación de comensalismo. Los experimentos de consumo de sustrato y de expresión diferencial de genes mostraron un aumento en el metabolismo de ambas bacterias en co-cultivo respecto al monocultivo, lo cual no necesariamente se relaciona con un aumento en el crecimiento, como es el caso de P. dorei. Las interacciones de cross-feeding fueron evidentes en inulina, ya que P. dorei degradó los polisacáridos a fructosa que luego L. symbiosum pudo consumir. El lactato y succinato también fueron alimentados de forma cruzada en cultivos con ambas fuentes de carbono, lo cual concuerda con simulaciones realizadas en nuestro laboratorio. P. dorei produjo propionato en medio estándar (mZMB) y en mZMB con xilano, mientras que ambas bacterias produjeron mayor concentración de acetato en xilano. La producción de butirato está directamente vinculada con el crecimiento de L. symbiosum, siendo mayor en co-cultivo respecto al monocultivo e independiente de la fuente de carbono utilizada. Estos resultados muestran un ejemplo interesante de interacciones metabólicas microbianas y su importancia sobre el potencial efecto beneficioso para el huésped.
Characterization of metabolic interactions between bacteria of the intestinal microbiome during the utilization of dietary fibers
(2023) Vega Sagardía, Marco Antonio; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El microbioma intestinal es una comunidad de microorganismos anaeróbicos. Esta composición puede ser modulada por la ingesta de alimentos ricos en fibras dietéticas, como prebióticos, que son polisacáridos complejos no modificados en el intestino delgado. Estos son fermentados selectivamente por bacterias intestinales, otorgando un beneficio a la salud del huésped. Dentro de estas fibras se incluye la inulina, y el xilano. La inulina es un fructano que es encontrado en cebollas y achicorias. Por otra parte, xilano es un polisacárido complejo de unidades de xilosa con cadenas laterales sustituidas, encontrado en las paredes celulares de las plantas como el maíz. Además, en el microbioma intestinal, existen interacciones bacterianas positivas (cross-feeding), o negativas (competencia) mediadas por el consumo de estas fibras. En este estudio se evaluaron interacciones bacterianas de diferentes cepas del microbioma intestinal de Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacteroides, and Phocaeicola mientras consumen inulina o xilano. Ensayos bidireccionales en xilano mostraron que Bifidobacterium longum PT4 aumentó su crecimiento en presencia de Bacteroides ovatus HM222. Los análisis proteómicos indicaron que B. ovatus sintetizó enzimas que degradan xilano, como β-xilanasa, arabinosidasa, y xilosidasa. En presencia de B. ovatus, B. longum PT4 aumentó la producción de enzimas para consumir xilooligosacáridos, como α-L-arabinosidasa, L-arabinosa isomerasa, xilulosa quinasa, xilosa isomerasa y transportadores de azúcar. Por otra parte, ensayos bidireccionales en inulina mostraron un predominio de la competencia por esta fibra por parte de Lacticaseibacillus paracasei M38, cuando interactuó con otras cepas intestinales comensales (Ligilactobacillus ruminis PT16, B. longum PT4 y Bacteroides fragilis HM714) que se vieron desfavorecidas. Los estudios proteómicos destacaron el aumento en cocultivos de las enzimas que degradan la inulina, como la β-fructosidasa, el sistema de transporte PTS D-fructosa y ABC. Posibles características fenotípicas de L. paracasei le dieron una ventaja adaptativa en condiciones adversas. Los resultados confirman la complejidad de las interacciones metabólicas intestinales, las que pueden ser positivas o negativas dependiendo de las cepas involucradas.
Characterization of metabolic interactions mediated by human milk oligosaccharides for the identification of key species in the infant gut microbiome
(2023) Díaz Guerra, Romina Giselle; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Los infantes alimentados con leche materna poseen un microbioma intestinal generalmente dominado por especies de Bifidobacterium, con contribuciones de enterobacterias, cepas de Bacteroides y bacterias lácticas. Esta dominancia se explica en gran parte por los oligosacáridos de leche materna (HMO). Las interacciones metabólicas de las especies de Bifidobacterium con otros microorganismos intestinales son esenciales para el ensamblaje del microbioma, ya que estimulan el desarrollo inmunitario y previenen la colonización de patógenos. Sin embargo, no se ha prestado suficiente atención a cómo microorganismos de esta comunidad son capaces de cooperar o competir durante la utilización de carbohidratos complejos como lo son los HMO. El objetivo general de este trabajo será determinar interacciones metabólicas entre microorganismos representativos del microbioma intestinal infantil, mediadas por oligosacáridos de leche materna, para identificar microorganismos clave en la función metabólica de la comunidad. Como objetivos específicos se plantean 1) definir y caracterizar mediante genómica comparativa un consorcio de microorganismos aislados del microbioma intestinal humano; 2) determinar interacciones metabólicas unidireccionales y bidireccionales de microorganismos del microbioma intestinal infantil, durante la utilización de oligosacáridos de leche materna; 3) identificar especies clave en un consorcio de microorganismos para el consumo de HMO, mediante un estudio de deleción de especies en un biorreactor batch. Para alcanzar estos objetivos, contaremos con un set de microorganismos obtenidos de colección o aislados de recién nacidos, incluyendo los géneros Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lachnoclostridium y Bacteroides. Mediante estudios de cultivo en condiciones anaeróbicas in vitro, se estudiará cómo estas especies interactúan metabólicamente durante el consumo de HMO. Además, se realizará un estudio de deleción de especies para identificar microorganismos clave en el consumo de HMO. Esto permitirá identificar cuáles de ellos son críticos para la abundancia de especies, la utilización de HMO y la producción de metabolitos. Este trabajo aportará conocimiento en la identificación de interacciones metabólicas entre microorganismos del microbioma intestinal infantil. Además, podremos identificar especies clave de un consorcio en el consumo de HMO con el fin de desarrollar consorcios microbianos con propiedades terapéuticas en los recién nacidos.
Comparative transcriptomics reveals key differences in the response to milk oligosaccharides of infant gut-associated bifidobacteria
(2015) Garrido Cortés, Daniel; Ruiz-Moyano, Santiago; Lemay, Danielle G.; Sela, David A.; German, J. Bruce; Mills, David A.
Construcción de un modelo dinámico basado en interacciones metabólicas entre especies del microbioma intestinal infantil
(2017) Pinto Chávez, Francisco Matías; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El microbioma intestinal es una comunidad microbiana compleja que tiene una influencia importante en el huésped. Las interacciones microbianas en el intestino están influenciadas por sustratos de la dieta, especialmente polisacáridos complejos. En este ambiente, productos de degradación de polisacáridos más complejos, y de ácidos grasos de cadena corta liberados al medio por microorganismos, pueden ser utilizados por otros. El poder entender las fuerzas que guían el desarrollo del microbioma intestinal y su composición es importante para determinar su rol en salud y en la aplicación del microbioma intestinal como una herramienta terapéutica. Recientemente, aproximaciones desde el modelamiento matemático, como análisis de modelos y series de tiempo, modelos metabólicos a escala genoma, han sido útiles para predecir las interacciones microbianas. En este estudio, se siguió un enfoque bottom-up para desarrollar un modelo matemático basado en ecuaciones de crecimiento microbiano, pero que incorporan interacciones metabólicas entre microorganismos. El modelo fue desarrollado utilizando datos experimentales in vitro de un consorcio bacteriano simple de cuatro especies del microbioma intestinal infantil, durante el crecimiento en fructooligosacáridos (FOS). Generalmente el modelo predijo con buena exactitud la abundancia bacteriana en co-cultivos desde datos de monocultivo. Además, se observó una buena correlación entre los datos experimentales de consumo de FOS y la producción de ácido y lo predicho por el modelo. Bifidobacterium infantis y Lactobacillus acidophilus fueron los microorganismos dominantes en estos experimentos. Se realizó posteriormente una validación del modelo, usando un sistema más óptimo para el crecimiento microbiano como un biorreactor anaeróbico, usando las cuatro especies y FOS como fuente de carbono. El modelo fue capaz de predecir el predominio de las dos especies mencionadas, así como la producción de acetato y lactato. Por último, el modelo fue testeado por su sensibilidad e identificabilidad de parámetros. Estos resultados sugieren que cambios en la abundancia bacteriana en el microbioma pueden ser explicados por interacciones metabólicas, y que un modelo matemático que incorpora estas interacciones puede predecir el comportamiento de un consorcio simple de especies, desde información de crecimiento en mono y en co-cultivo. En el futuro, el modelo podría ampliarse para incluir datos de consorcios bacterianos más grandes, o ser aplicado a otras comunidades microbianas donde las interacciones metabólicas sean relevantes. Por otra parte, el modelo podría ser útil en el diseño de consorcios microbianos con propiedades deseadas, como por ejemplo una mayor producción de ácido.
Development of rule-based models for regulatory mechanisms of gene expression and bacterial metabolism
(2020) Santibáñez Palominos, Rodrigo Alberto; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El modelado de sistemas es un amplio campo en ciencias e ingeniería enfocado en entender cómo los componentes de un sistema evolucionan a través del tiempo y espacio. Por siglos, el modelado ha sido usado para la descripción de una variedad de sistemas simples y con la llegada de la computación, hemos sido capaces de modelar sistemas altamente detallados, analizarlos y proponer hipótesis para posterior testeo experimental. En esta tesis doctoral, la utilización de modelos basados en reglas fue propuesta para el rápido desarrollo de modelos borradores describiendo la regulación de la expresión génica bacteriana. La metodología desarrollada es capaz de modelar transcripción, traducción y la degradación de macromoléculas así como también el metabolismo bacteriano. Los procesos anteriormente mencionados son esenciales para la viabilidad celular, aunque el modelado es ampliamente adoptado para el metabolismo. Para sobrepasar el lento desarrollo de modelos, la proposición de modelado está acompaña por el desarrollo de herramientas computacionales para modelar automáticamente cada proceso, una técnica previamente disponible solo para modelos metabólicos. La regulación de la expresión génica es esencial para la homeostasis celular y adaptación. Esta regulación depende de factores transcripcionales y otras proteínas que unen específicamente secuencias de ADN y controlan programas genéticos. Sin embargo, la complejidad de esta red regulatoria impide esfuerzos para modelar regulación génica a escala genómica. En primer lugar, nosotros proponemos una metodología construida sobre Kappa BioBrick Framework, la cual fue automatizada y extendida para describir correctamente la arquitectura del genoma, la iniciación de la transcripción bacteriana, e incorporar el metabolismo. Desarrollamos Atlas, un software que es capaz de convertir las muchas interacciones y reacciones codificadas en redes biológicas en modelos basados en reglas. Reglas son similares a ecuaciones químicas describiendo únicamente las características involucradas en una reacción. Al hacer eso, una regla puede representar miles o incluso millones de reacciones individuales. El método fue empleado con datos conocidos de regulación génica y reacciones metabólicas de la bacteria Escherichia coli. Luego, desarrollamos Pleione, un software que emplea un algoritmo genético para calibrar modelos basados en reglas. La herramienta da soporte a cuatro simuladores estocásticos (compatible con dos lenguajes de reglas). Pleione distribuye simulaciones y cálculos de bondad de ajuste en infraestructuras de computación de alto rendimiento, y más importantemente, aprovecha pruebas estadísticas de equivalencia para determinar la pertinencia de simulaciones estocásticas a datos experimentales. También desarrollamos herramientas para estimar la incertidumbre en calibración de parámetros y para estimar índices de sensibilidad de parámetros seleccionados por el usuario. El modelado es visto como una tarea especializada, inaccesible sin el conocimiento apropiado de métodos de modelado. Atlas toma inspiración en herramientas disponibles para reconstruir borradores de modelos metabólicos a escala genómica, y esta tesis satisfactoriamente presenta una biblioteca de software para desarrollar y analizar modelos basados en reglas para regulación génica y metabolismo en bacteria. Las herramientas desarrolladas permiten evaluar el impacto de modificaciones como variación del número de copias génicas, arquitectura del genoma, y otras modificaciones génicas comunes para entender la fisiología bacteriana, patogenicidad, y eventualmente, la ingeniería de células bacterianas para aplicaciones de biotecnología y biomedicina. Las herramientas presentadas en esta tesis doctoral son de código abierto y disponibles libremente para descarga desde el Índice de Paquetes de Python y desde github.com/networkbiolab/pleione y github.com/networkbiolab/PythonCyc.
Diseño de un circuito génico para la expresión de sfGFP y GM-CSF reprimida por butirato
(2023) Serebrinsky Duek, Kineret Rivka; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Las enfermedades de inflamación intestinal, EII, son enfermedades crónicas multifactoriales con síntomas recurrentes que afectan en gran medida la calidad de vida de quienes la padecen. A pesar de no entenderse del todo las causas, se sabe que la disbiosis de la microbiota intestinal es parte de ellas. El butirato es uno de los metabolitos más importantes que aporta la microbiota al hospedero y se ha visto una correlación entre la diminución de su concentración con cuadros activos de inflamación intestinal en pacientes con EII. En el último tiempo, la construcción de biosensores y bioterapéuticos para diagnóstico y tratamiento de enfermedades, incluidas las EII, ha ido en aumento. La utilización de estos organismos genéticamente modificados trae muchos beneficios, como la disminución de la exposición sistémica del terapéutico, un mayor control y especificidad de la administración de la droga, la reducción de los efectos secundarios, entre otros. En este trabajo se construyó un circuito génico capaz de detectar la concentración de butirato para inducir la expresión del represor LacI, y este, a su vez, reprimir la producción de la proteína de interés. De esta forma se crearon dos biosensor capaces de expresar la proteína fluorescente sfGFP de manera inversamente proporcional a la concentración de butirato en un rango entre 30 y 90 mM del compuesto. El sistema presenta un coeficiente de Hill de 3.14 y una constante de disociación de 86.6 mM. También, se crearon dos bioterapéuticos capaces de expresar la citoquina factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos, GM-CSF, bajo la misma lógica. Los bioterapéuticos presentan el comportamiento deseado durante las primeras 2 y 4 horas de crecimiento. Los resultados son promisorios, aunque el circuito debe ser modificado para poder ser usado en un contexto biológico y más pruebas son requeridas para perfeccionar el mecanismo de detección y respuesta.
Distinct patterns in the gut microbiota after surgical or medical therapy in obese patients
(2017) Medina, D. A.; Pedreros, J. P.; Turiel, D.; Quezada Sanhueza, Nicolás; Pimentel Muller, Fernando; Escalona, Alex; Garrido Cortés, Daniel
Draft genome sequences of Cylindrospermopsis raciborskii strains CS-508 and MVCC14, isolated from freshwater bloom events in Australia and Uruguay
(2018) Fuentes Valdés, Juan José.; Soto Liebe, Katia Leandra.; Belmar, Lucy.; Garrido Cortés, Daniel; Vásquez, Mónica.; Pérez-Pantoja, Danilo.; Tamames, Javier.; Pedrós-Alió, Carlos.
Abstract Members of the genus Cylindrospermopsis represent an important environmental and health concern. Strains CS-508 and MVCC14 of C. raciborskii were isolated from freshwater reservoirs located in Australia and Uruguay, respectively. While CS-508 has been reported as non-toxic, MVCC14 is a saxitoxin (STX) producer. We annotated the draft genomes of these C. raciborskii strains using the assembly of reads obtained from Illumina MiSeq sequencing. The final assemblies resulted in genome sizes close to 3.6 Mbp for both strains and included 3202 ORFs for CS-508 (in 163 contigs) and 3560 ORFs for MVCC14 (in 99 contigs). Finally, both the average nucleotide identity (ANI) and the similarity of gene content indicate that these two genomes should be considered as strains of the C. raciborskii species.
Engineered bacteria for propionate-repressed expression of sfGFP and GM-CSF
(2021) Barra, María José; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic diseases that currently have no cure. Their causes are multifactorial, but the composition of the gut microbiome is believed to play an important role in their development. Certain beneficial bacteria in the microbiome are able to ferment dietary fibers and produce short chain fatty acids (SCFA), such as propionate, that help protect intestinal integrity and prevent the colonization of pathogens. These are found in reduced concentrations in people who suffer from IBD. Taking advantage of the ability of bacteria to colonize the human body, they have been engineered to act as biosensors to detect specific biomarkers which can be used as complimentary diagnostic tools. They have also been genetically modified to act as drug delivery vehicles, helping to increase target specificity and avoid harmful side effects. In this work, we develop a two plasmid system in E. coli DH5α in which propionate induces the expression of the LacI repressor. In the second plasmid, the repressor controls the expression of the reporter protein, sfGFP. We observed that the genetic circuit functions between 0-110 mM of propionate with at least 0.1 mM generating a response. We then replaced sfGFP with the gene for the cytokine, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), which was chosen due to its reported effects in strengthening the intestinal epithelium barrier. After 4 hours of growth and in the absence of propionate, 11.61 μg/mL of GM-CSF/OD600 were produced, while 8.959 μg/mL were produced in the presence of 100 mM of the inductor. Nevertheless, the differences in the concentration of GM-CSF produced were minimal between the two conditions after this time. Additionally, the concentration of GM-CSF produced rapidly declined after 4 hours, likely being degraded within the cell. Overall, the reporter strain may function as a complementary diagnostic tool for quantifying propionate and the therapeutic strain may work as a delivery vehicle for GM-CSF, although further studies are required to perfect the sense and respond mechanism.
Evaluating the Capacity of Human Gut Microorganisms to Colonize the Zebrafish Larvae (Danio rerio)
(2018) Valenzuela, María José; Caruffo, Mario; Herrera, Yoani; Medina, Daniel A.; Coronado, Máximo; Feijoo, Carmen G.; Muñoz, Salomé; Garrido Cortés, Daniel; Troncoso, Miriam; Figueroa, Guillermo; Toro, Magaly; Reyes Jara, Angélica; Magne, Fabien; Navarrete, Paola
Genome-scale metabolic modeling of the human milk oligosaccaharide utilization metabolims by bifidobacterium longum subsp. infantis
(2021) Román Lagos, Loreto Andrea; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Los modelos metabólicos a escala genómica (GSMMs por su sigla en inglés) son representaciones matemáticas de la estequiometría de las reacciones metabólicas, desarrollados para simular condiciones de crecimiento e interacciones. Bifidobacterium longum subsp. infantis es una de las especies mas representativas del intestino infantil, asociada a una buena salud en el recién nacido y reconocida como una bacteria beneficiosa. Este organismo depende de su actividad sacarolítica para obtener fuentes de carbono, y es considerado un organismo modelo de utilización de oligosacáridos de leche humana (HMOs por su sigla en inglés). HMOs son moléculas diversas incluyendo lactosa, lacto-N-tetraosa (LNT), lacto-N-neotetraosa (LNnT), 2-fucosil lactosa (2FL), 3- fucosil lactosa (3FL) y 6-sialil lactosa (6SL). Los detalles moleculares respecto a la utilización de HMO son bien entendidos. Sin embargo, las vías metabólicas expresadas para el uso de cada carbohidrato y sus consecuencias metabólicas no han sido del todo abordadas. En este estudio, reconstruimos el metabolismo de este microorganismo utilizando la anotación de B. infantis ATCC 15967 desde AGORA, además se realizó una revisión de los genomas anotados y la literatura actual. La reconstrucción (iLR554) cuenta con 554 genes, 1078 reacciones (747 reacciones asociadas a genes) y 933 metabolitos. La curación fue hecha usando información de RNA-seq para cerrar los gaps del modelo. Los datos de transcriptómica fueron luego integrados en la simulación extrayendo modelos específicos para fuentes de carbono mediante el algoritmo GIMME. iLR554 fue capaz de evidenciar varias diferencias en el metabolismo de HMOs dependiendo de las características funcionales de los compuestos. La producción de metabolitos importantes como lactato y acetato fue común a todos los sustratos. Sin embargo, nuestro modelo predijo pequeñas producciones de succinato, formiato y etanol. Si bien los datos de RNA-seq fueron útiles, se observó una baja correlación entre los flujos metabólicos y datos transcripcionales. Este trabajo es una plataforma útil para simular el metabolismo de una bacteria prominente en el intestino infantil, y diseñar simbióticos comerciales o consorcios bacterianos que contengan especies del género Bifidobacterium.
Genomic characterization of Cylindrospermopsis raciborskii : a cyanobacterium able to produce bioactive compounds
(2019) Fuentes Valdés, Juan José; Garrido Cortés, Daniel; Vásquez Pérez, Luz Mónica; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Las cianobacterias son microorganismos esenciales para la vida, ya que, desarrollan el proceso de fotosíntesis y fijación de nitrógeno atmosférico. Los compuestos producidos por estos microorganismos tienen un potencial biotecnológico destacable, sin embargo, también son responsables de generar intoxicaciones graves producto del consumo de agua contaminadas, como es el caso de la intoxicación por la toxina saxitoxina. Avances en genómica y bioinformática han facilitado el descubrimiento de nuevos compuestos además de ayudar a comprender su evolución cianobacteriana y diseminación en el medio ambiente. En esta tesis, mediante un enfoque molecular se buscó e identificó un grupo de compuestos bioactivos, además de proporcionar una caracterización molecular y química de las moléculas identificadas. El primer objetivo fue obtener las secuencias genómicas de aislamientos de Cylidrospermopsis raciborskii australianos y desarrollar un análisis de genómica comparativa, para comprender su relación genética con la especie brasileña Raphidiopsis brookii, con un enfoque especial en la producción de saxitoxina. En general, observamos una fuerte correlación biogeográfica entre las cepas analizadas. La comparación genómica del grupo C. raciborskii y R. brookii mostró un alto grado de similitud en términos globales, sin embargo, se observaron diferencias significativas en términos de la biosíntesis de metabolitos secundarios. En segundo lugar, los clústeres de genes para metabolitos secundarios identificados en los genomas de Cylindrospermopsis, se estudiaron a nivel molecular. Se determinó el potencial de C. raciborskii para producir compuestos activos del tipo hassallidinas y saxitoxinas. Usando LC-MS / MS determinamos el perfil de hsasallidina en C. raciborskii CS-505, e identificamos una nueva variante de hassallidina en la cepa CS-509. Curiosamente, no logramos detectar hassallidina en extractos de C. raciborskii CS-508, a pesar de la presencia del cluster de genes aparentemente completo. Esto podría explicarse por mecanismos reguladores o mutaciones puntuales. Finalmente, determinamos el perfil de saxitoxina en la cepa C. raciborskii MVCC14, que resultó ser el mismo perfil identificado en R. brookii D9. Cylindrospermopsis raciborskii y Raphidiopsis brookii se clasifican morfológicamente como especies diferentes, mediante análisis de genómica comparativa los datos sugieren que ambos podrían ser miembros de la misma especie. En resumen, este trabajo proporcionó información importante referente a genomas cianobacterianos, determinando las estructuras genéticas responsables de la producción de metabolitos secundarios de compuestos de importancia biotecnológica como hassallidina y saxitoxina.
Glycosylated proteins preserved over millennia : N-glycan analysis of Tyrolean Iceman, Scythian Princess and Warrio
(2014) Ozcan, Sureyya; Kim, Bum Jin; Ro, Grace; Kim, Jae-Han; Bereuter, Thomas L.; Reiter, Christian; Dimapasoc, Lauren; Garrido Cortés, Daniel; Mills, David A.; Grimm, Rudolf; Lebrilla, Carlito B.; Joo An, Hyun
Human milk oligosaccharides and infant gut bifidobacteria : molecular strategies for their utilization
(2018) Thomson, Pamela; Medina, Daniel; Garrido Cortés, Daniel
Identificación de interacciones metabólicas clave en consorcios de microbioma mediante la deleción de especies
(2018) Gutiérrez Wilde, Natalia Fernanda; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El microbioma intestinal es una compleja comunidad microbiana directamente vinculada a la salud humana. La dieta ha sido reconocida como uno de los factores de mayor impacto sobre la composición del microbioma. El consumo de carbohidratos no digeribles se ha asociado a la producción bacteriana de ácidos grasos de cadena corta otorgando beneficios en la salud, especialmente butirato que presenta acción anti-inflamatoria. Por el contrario, ciertas alteraciones en la composición microbiana (disbiosis) se han asociado a enfermedades metabólicas. En el microbioma los microorganismos pueden formar redes tróficas de interacciones metabólicas, mediante cross-feeding de productos de degradación y fermentación. Interesantemente estas redes poseen una marcada redundancia funcional. Es esencial comprender la complejidad de las interacciones bacterianas y cómo la presencia o ausencia de un microorganismo específico afecta la integridad y funcionamiento del sistema. En este trabajo se estudió un consorcio de catorce bacterias pertenecientes al microbioma intestinal durante cultivos batch en biorreactores con inulina como sustrato. Los experimentos consistieron en la deleción de una especie microbiana a la vez, para evaluar el impacto de su eliminación sobre el sistema y sus interacciones. El consumo de sustrato, las abundancias relativas y producción de metabolitos fueron cuantificados en cada biorreactor. Consorcios sin Escherichia coli, Bifidobacterium adolescentis, Bacteroides dorei, Lactobacillus plantarum y Clostridium symbiosum no produjeron butirato, al mismo tiempo que la abundancia de C. symbiosum mostró ser la más sensible y relacionada positivamente con la presencia de E. coli, B. adolescentis, B. dorei y L. plantarum. La ausencia de B. dorei redujo significativamente la cantidad de lactato y aumentó la concentración de acetato. Además, B. dorei junto a otras bacterias resultaron ser esenciales para la robustez de la comunidad. Se propuso finalmente un consorcio de siete especies para lograr una alta producción de butirato. En conclusión, la metodología de remoción de una especie a la vez permitió encontrar interacciones significativas entre microorganismos y evidenciar roles metabólicos a partir de sus contribuciones a la estabilidad del sistema.
Identification of Oligosaccharides in Feces of Breast-fed Infants and Their Correlation with the Gut Microbial Community
(2016) Jasmine, C. C.; Davis, Sarah M.; Totten, Julie O.; Huang, Sadaf Nagshbandi; Kirmiz, Nina; Garrido Cortés, Daniel; Lewis, Zachery T.; Wu, Lauren D.; Smilowitz, Jennifer T.; German, J. Bruce; Mills, David A.; Lebrilla, Carlito B.
Impacto de consorcios microbianos productores de metabolitos neuroprotectores en un modelo de neurodegeneración animal
(2024) Ovalle Alava, Aline Michelle; Garrido Cortés, Daniel; Sierralta Jara, Jimena; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El microbioma intestinal humano representa un ecosistema microbiano diverso y complejo que cumple importantes funciones que inciden sobre la salud del huésped. En los últimos años se ha evidenciado su influencia sobre enfermedades del sistema nervioso donde la comunicación bidireccional definida como eje microbioma-intestino-cerebro desempeña un rol fundamental. En esta comunicación la producción de neurometabolitos por el microbioma intestinal ha mostrado ser clave en la modulación del sistema nervioso. En particular GABA, el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central (SNC), ha exhibido un rol en la modulación de la depresión, ansiedad y en la neurodegeneración. Asimismo, butirato, uno de los ácidos grasos de cadena corta que cumple funciones fisiológicas importantes en el huésped, ha mostrado mantener la barrera hematoencefálica, regular procesos neuroinflamatorios y tener un efecto neuroprotector.El estudio del impacto del microbioma intestinal sobre enfermedades del sistema nervioso se ha llevado a cabo mediante el uso de sistemas in vitro y modelos animales donde se evalúa el tratamiento del efecto de una o más cepas bacterianas sobre una condición determinada. Sin embargo, en los últimos años, la aplicación de ingeniería de consorcios microbianos ha despertado creciente interés para el diseño racional y controlado de comunidades microbianas con funciones específicas. Este enfoque permite predecir de manera robusta la composición e interacciones microbianas claves. A pesar de las ventajas que ofrecen estos métodos, actualmente su uso no ha sido descrito en el estudio del impacto del microbioma sobre la neurodegeneración.El objetivo general de esta propuesta fue estudiar el impacto de consorcios microbianos optimizados para la producción de GABA y butirato sobre la neurodegeneración en un modelo animal. En línea con esto los objetivos específicos fueron: 1) Diseñar consorcios microbianos de bacterias intestinales optimizados para la producción de GABA y butirato; 2) Caracterizar, validar y producir los consorcios microbianos productores de GABA y butirato que se diseñaron in silico a escala de laboratorio en un biorreactor batch; 3) Evaluar la neurodegeneración en un modelo animal tras el tratamiento con los consorcios microbianos. Para lograr estos objetivos en una primera etapa se realizaron simulaciones de la comunidad microbiana con modelos a escala genómica (GSMMs) de las bacterias productoras de GABA, butirato y bacterias residentes representativas del microbioma intestinal utilizando el algoritmo de diseño de comunidades microbianas SteadyCom. Este algoritmo se implementó en el paquete COBRA de MATLAB. Posteriormente, los consorcios bacterianos optimizados in silico se evaluaron en un biorreactor batch donde se obtuvo información sobre la abundancia de las bacterias, producción de neurometabolitos y consumo de sustrato durante la fermentación. Finalmente, se estudió el efecto de uno de los consorcios sobre la neurodegeneración en un modelo de Parkinson en Drosophila melanogaster, donde se evaluó la capacidad locomotora, sobrevida, la integridad neuronal y el perfil de metabolitos sobre-expresados tras el tratamiento con el consorcios bacterianos.Los resultados indicaron que el tratamiento con el consorcio bacteriano no tiene un efecto negativo en la sobrevivencia de D. melanogaster aumentando inclusive su sobrevida. Produce un rescate fenotípico locomotor en moscas con la enfermedad de 10 y 25 días de edad. Restaura el perfil de metabolitos alterados asociados al balance energético, redox, metabolismo de aminoácidos y neurotransmisores, así como también reduce el nivel de biomarcadores asociados la enfermedad. Por último, el consorcio modula el microbioma intestinal en el modelo de Parkinson, lo que podría ser un mecanismo para reducir la patología de la enfermedad. En síntesis la presencia del consorcio bacteriano produce un cambio en la composición del microbiona intestinal de Drosophila Parkinsoniana, donde la producción bacteriana del neurotransmisor GABA y otros intermediaros metabólicos, su degradación en moléculas benéficas y la interacción con otros miembros del microbioma intestinal podría favorecer el balance del microbioma, reducir las alteraciones metabólicas de la enfermedad, mejorando la comunicación del eje microbioma-intestino-cerebro, reduciendo así los síntomas locomotores asociados a la enfermedad y logrando tener un efecto neuroprotector en un modelo de Parkinson en Drosophila melanogaster.
Interacciones mediadas por prebióticos en un consorcio modelo del microbioma intestinal infantil
(2016) Ovalle Alava, Aline Michelle; Garrido Cortés, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El microbioma intestinal infantil es una compleja comunidad de microorganismos que es clave en el desarrollo del recién nacido. La dieta y tipo de interacción de los microorganismos son los principales factores que modulan la composición de este durante los primeros años de vida. En general se sabe poco sobre la relación entre la dieta e interacciones bacterianas. Con el objetivo de entender esta se desarrolló un modelo in vitro para el estudio de las interacciones de un consorcio de bacterias representativas de los cuatro filos más abundantes del microbioma intestinal infantil formado por Bifidobacterium longum subsp. infantis, Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli y Bacteroides vulgatus. Se adaptó un medio de cultivo (mZMB-1) que simuló algunas de las condiciones del colon proximal y permitió el buen crecimiento de las cuatro bacterias. Luego, éste se usó para evaluar las interacciones entre las bacterias del consorcio en respuesta a prebióticos de la dieta del recién nacido, como 2-fucosil-lactosa (2FL) y fructooligosacáridos (FOS), característicos de la leche materna y fórmula infantil, respectivamente.Siguiendo este propósito se realizaron experimentos en mono y co-cultivo para cada bacteria con estos sustratos, se midió su abundancia por qPCR y estimó el consumo porcentual de estos prebióticos. Por último se utilizó el modelo ecológico de Lotka-Volterra para predecir el tipo de interacción entre ellas. Los resultados indicaron que en 2FL como fuente de carbono, B. infantis dominó la fermentación, mientras que en FOS B. vulgatus y B. infantis actuaron como fermentadores primarios. 2FL fue un prebiótico más específico para B. infantis, mientras que en FOS el consumo fue más activo. Las interacciones predominantes en ambos prebióticos fueron negativas, mientras que 2FL produjo cambios más sutiles al interior de la comunidad, en FOS fueron más profundos. La naturaleza química de estos prebióticos moduló el tipo de interacción entre las bacterias del consorcio infantil.

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