3.01 Tesis doctorado

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Bioprocess engineering and metabolic modeling as a roadmap for enhanced recombinant protein production in Pichia pastoris
(2019) Torres Plaza, Paulina Macarena; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Pichia pastoris es reconocida como un workhorse biotecnológico para la expresión de proteínas recombinantes. Basándose en sus logros pasados y novedosos desarrollos, la biotecnología de sistemas de P. pastoris ha progresado significativamente en las últimas dos décadas. En esta tesis doctoral, el análisis sistemático de las condiciones operativas en conjunto con el desarrollo de herramientas computacionales y la selección de configuraciones mecánicas óptimas de bioreactores se llevaron a cabo como una hoja de ruta para mejorar la producción de proteínas recombinantes a través de la ingeniería de bioprocesos y el modelamiento metabólico. A pesar de que nosotros utilizamos una cepa de P. pastoris que expresaba constitutivamente la proteína endulzante taumatina, como caso de estudio, los desarrollos logrados también son aplicables para la expresión de otras proteínas recombinantes de interés. Primero, presentamos un marco integrado para revelar los efectos metabólicos de dos parámetros operacionales – la tasa específica de crecimiento y la concentración de oxígeno disuelto - en cultivos continuos limitados en glucosa. Más específicamente, empleamos un diseño experimental racional para calcular los efectos estadísticos significativos de los datos de múltiples quimiostatos, que luego fueron contextualizados utilizando un modelo metabólico a escala del genoma manualmente curado. Nuestros resultados revelaron un efecto negativo de la oxigenación en la tasa especifica de producción del producto y un efecto positivo en el rendimiento de la biomasa. En particular, identificamos un efecto sinérgico de ambos parámetros en la tasa específica de producción del producto. Finalmente, las predicciones del modelo indicaron una relación opuesta entre el nivel de oxigenación y el requerimiento de ATP asociado al crecimiento, sugiriendo un mayor gasto metabólico de crecimiento a bajo nivel de oxigenación. En segundo lugar, construimos un modelo metabólico a escala genómica dinámico para cultivos aeróbicos de Pichia pastoris limitados en glucosa. El modelo se empleó para analizar la distribución del flujo metabólicos de un cultivo alimentado por lotes y para diseñar estrategias genéticas y de ingeniería de procesos para mejorar la producción de albúmina sérica humana recombinante. Simulaciones de knock-outs individuales indicaron que la desviación del carbono hacia la formación de cisteína y triptófano podría mejorar en 63 veces la producción de HSA. Además, el modelo sugirió que la implementación de una tasa de crecimiento específica decreciente durante la fase de alimentación de un cultivo alimentado por lotes produce un aumento del 25% de la productividad volumétrica de la proteína. Finalmente, se llevó a cabo una optimización de la tasa de transferencia de oxígeno en reactores de 1 L. Para este propósito, primero discutimos la formulación de un algoritmo automático para la estimación de kLa bajo diferentes condiciones hidrodinámicas. Luego, presentamos una hoja de ruta para optimizar la tasa de transferencia de oxígeno en bioreactor de 1-L, utilizando diferentes configuraciones de aspas-difusor. La importancia relativa de la aireación y agitación bajo las diferentes configuraciones y condiciones hidrodinámicas fueron llevadas a cabo. Finalmente, propusimos un árbol de decisión para la selección de la mejor configuración con el fin de mejorar la transferencia de oxígeno en bioreactores según el rango de los parámetros operacionales y la viscosidad. En general, esta tesis es un intento exitoso de analizar y comprender los efectos metabólicos utilizando un diseño racional de experimentos y modelos metabólicos. Además, este análisis sistemático en cooperación con una optimización de la transferencia de oxígeno en bioreactores permitirá mejorar la producción de proteínas recombinantes en Pichia pastoris.
Construction of a yeast platform for the synthesis of high value natural flavours
(2016) López Salinas, Javiera C.; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
La ingeniería metabólica ha abierto una oportunidad para la producción de una amplia variedad de compuestos de alto valor industrial, especialmente aquellos producidos en bajas concentraciones desde fuentes no-renovables, o cuya síntesis química es difícil y costosa. En el caso de los terpenos, existen numerosas oportunidades y estrategias para su síntesis bioquímica usando microorganismos naturales o “ingenierizados”. Saccharomyces cerevisiae es uno de los principales microorganismos usados para la expresión heteróloga de genes, debido principalmente a su rápido crecimiento en diferentes fuentes de carbono, el amplio conocimiento de su genoma y las herramientas para su manipulación, y su robustez en fermentaciones a gran escala. Además, en el caso de S. cerevisiae, la vía del mevalonato que lleva finalmente a la producción de ergosterol, es también capaz de producir precursores de compuestos de alto valor. Avances en el campo de la biología de sistemas, ingeniería evolutiva, y biología sintética han acelerado el progreso para el uso de esta levadura como la factoría celular microbiana de elección.En este trabajo se construyeron una serie de plataformas en levadura para la síntesis de dos tipos de terpenos: el monoterpeno carvona y el norisoprenoides β-ionona. Los monoterpenos son principalmente producidos por las plantas como mecanismo de defensa contra depredadores, y pueden ser usados por la industria de los alimentos como antisépticos, fragancias y aditivos. Los norisoprenoides son conocidos por su agradable aromas y también usados en la industria de alimentos como aditivos, pero además, altamente apreciados por la industria cosmética. En este estudio, se usaron diferentes promotores de expresión y plasmidios para controlar la transcripción y la dosis génica. Para la síntesis de norisoprenoides, se construyeron varias cepas de levadura, capaces de producir β-ionona. Primero, se integraron tres genes heterólogos en la cepa ingenierizada SCGI22a: los genes carotenogénicos crtYB y crtI de Xanthophyllomyces dendrorhous, para producir β-caroteno, y el gen dioxigenasa de escisión de carotenos, (gen PhCCD1), de Petunia hybrida, para producir β-ionona. En esta cepa se alcanzó una concentración final de 0,63 ± 0,02 mg/g biomasa en matraces. Una posterior expresión de estos tres genes en vectores de alta copia, mejoró la concentración final, alcanzando mas de 5 mg/L en cultivos batch (Capítulo 2).La acumulación de ß-caroteno en todas las cepas construidas, puede indicar una baja eficiencia en la actividad de la enzima CCD1, o una baja expresión de su gen. Debido a que en este estudio, la sobre-expresión de este gen resultó en cepas que crecían muy lento, se decidió cambiar el promotor original usado para este gen (PTEF1) por el promotor Gal1 inducible por luz. En este sistema, el factor de transcripción Gal1 fue dividido en sus dominios de unión a ADN (BD) y de activación (AC), y estos dos componentes fusionados a dos criptocromos de Neurospora crassa llamados White collar -1 (WC-1) y Vivid-1 (VVD1). Estas dos flavoproteínas responden a luz azul interaccionando una con otra, reconstituyendo el factor de transcripción Gal1. A pesar de que este sistema funcionó con un gen reportero, no se logró optimizar la producción de β-ionona, probablemente por la inducción prolongada con luz, lo que afectaría a los carotenos (Capítulo 3). Sin embargo, este sistema presenta varias ventajas y futuras optimizaciones son promisorias.Finalmente, utilizando el mismo diseño usado para la producción de norisoprenoides, se construyó una cepa de levadura para la producción de los monoterpenos limoneno y carvona (Chapter 4). Para ello, se expresaron cinco genes heterólogos: El gen GPPS de Abies grandis que codifica para la enzima geranil difosfato sintasa; los genes de Mentha piperita, LS, LH y CD para la producción de los monoterpenos limoneno, trans-carveol y carvona respectivamente; y una versión mutada del gen de levadura ERG20, que codifica para la enzima que produce geranil difosfato (GPP) y farnesil difosfato (FPP). Ningún monoterpeno fue detectado en cultivos de esta cepa, debido posiblemente a la volatilidad/toxicidad de los monoterpenos y la ausencia de su precursor directo GPP. Otras optimizaciones son necesarias. Aún hay mucho espacio para la optimización de las cepas creadas en este estudio. El conocimiento generado, junto con los extraordinarios avances en biología sintética, nos permitirán la posibilidad de producir compuestos industrialmente competitivos, a través de procesos sustentables y de bajo costo.
Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Oenococcus oeni and its functional analysis in malolactic fermentation
(2021) Cañón Amengual, Pablo Martín; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Oenococcus oeni es el agente principal de la fermentación maloláctica en vinos, responsable de la descarboxilación del ácido L-málico a ácido L-láctico. Es un proceso clave en la vinificación, reduciendo la acidez y aportando complejidad aromática y estabilidad microbiológica, pero es errático e impredecible Pese a su rol crucial, el proceso no es aún entendido del todo. Para mejorar la comprensión de la bacteria y el proceso, se construyó y curó el primer modelo metabólico a escala genómica de O. oeni cepa PSU-1 (iSM454). Luego, se estudió su crecimiento bajo distintas condiciones de etanol, determinando la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares, y, por último, se generó un modelo por homología de la enzima maloláctica. Los experimentos in silico revelaron que el modelo iSM454 predice los requerimientos nutricionales con una exactitud del 93%. Luego, éste se aplicó para determinar la energía de mantención no asociada a crecimiento. Los resultados mostraron que el O. oeni cultivado al 12% de concentración de etanol gastaba treinta veces más ATP para mantenerse vivo que en su ausencia. La mayor parte de este ATP era empleado en la extrusión de protones fuera de la célula. Los experimentos in vitro se llevaron a cabo en MaxOeno, un medio de cultivo definido y similar al vino, desarrollado y optimizado para el estudio. La integración de los datos experimentales con el modelo permitió determinar la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares bajo diferentes condiciones de etanol (0 a 12% v/v). Se identificaron claramente cuatro fases de crecimiento durante el cultivo por lote de la cepa PSU-1 del O. Oeni, según el consumo de los ácidos málico y cítrico, la absorción de azúcares y aminoácidos, y las tasas de biosíntesis de productos metabólicos – biomasa, eritritol, manitol y ácido acético, entre otros. Se halló que, bajo condiciones de etanol crecientes, el O. oeni favorece reacciones anabólicas relacionadas con el mantenimiento celular, mientras los requerimientos de NAD(P)+ y ATP aumentan. Finalmente, se usó un modelo por homología de la enzima maloláctica y la técnica de quantum polarized ligand docking para describir el sitio de unión y ubicación del ácido L-málico (MAL) y sus estados desprotonados MAL- y MAL2-. MAL2- tuvo el más bajo ΔGbinding, seguido por MAL- y MAL, con valores de −23.8, −19.6 y −14.6 kJ/mol, respectivamente, consistente con los valores obtenidos en los ensayos de titulación de calorimetría isotérmica (ITC). Los resultados de dinámica molecular y de MM/GBSA sugieren que sólo el MAL2- exhibe una conformación abierta extendida en el sitio de unión, que cumple los requerimientos geométricos para la coordinación con Mn2+, componente crítico de la actividad de la enzima maloláctica. Se espera que iSM454 y el modelo de homología para la enzima maloláctica descritos aquí, provean herramientas únicas para comprender y predecir la compleción de la fermentación maloláctica en el vino por O. Oeni, así como los inconvenientes que el proceso puede eventualmente afrontar en cualquier condición físico-química particular.
Heterologous production of the epoxycarotenoid violaxanthin in Saccharomyces cerevisiae
(2020) Cataldo von Bohlen, Vicente Francisco; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
La producción de carotenoides en microorganismos se ha centrado en moléculas clásicas como β-caroteno, licopeno y astaxantina. Sin embargo, existen carotenoides menos estudiados que también poseen interesantes propiedades y aplicaciones. Este es el caso de la violaxantina, un epoxicarotenoide presente en plantas, que posee una potente actividad antioxidante y es precursor de otras moléculas de interés comercial como la β-damascenona y la fucoxantina. En este trabajo se reportan por primera vez cepas de levadura productoras de epoxicarotenoides. Para esto, utilizando herramientas de ingeniería metabólica a varios niveles, se construyeron cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae capaces de producir violaxantina. En primer lugar, partiendo de una cepa β-carotenogénica, se evaluaron enzimas β-caroteno hidroxilasas (CrtZ/CrtR-b2) y zeaxantina epoxidasas (ZEP) de diferentes especies, en conjunto con sus versiones truncadas en diversas posiciones aminoterminales. El mejor desempeño se logró con la expresión combinada de una CrtZ de Pantoea ananatis y una ZEP truncada de Haematococcus lacustris, llevando a un rendimiento de violaxantina de 1.6 mg/gDCW. Posteriormente, con el objetivo de incrementar la actividad epoxidasa, se co-expresaron diferentes sistemas accesorios de oxidorreducción, que promueven la transferencia de equivalentes reductores hacia la enzima ZEP. La co-expresión de una ferredoxina-3 truncada y una ferredoxina oxidorreductasa-1 truncada incrementó el rendimiento de biosíntesis de violaxantina en 2.2 veces (3.5 mg/gDCW). Finalmente, un aumento en el número de copias de los genes carotenogénicos permitió incrementar el rendimiento de este carotenoide a 7.3 mg/gDCW, que corresponde al mejor rendimiento de violaxantina producida en microrganismos reportado hasta la fecha.
Organoleptical properties of natural, non-caloric sweeteners : molecular simulation, mixture optimization and experimental validation in carbonated soft drinks
(2017) Acevedo Castillo, Waldo Andrés; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
El azúcar ha jugado históricamente un papel principal como edulcorante de la mesa y en la preparación de varios productos alimenticios. Sin embargo, en la actualidad, se ha determinado que un número significativo de enfermedades crónicas, no transmisibles son una consecuencia del consumo excesivo de azúcar. Estas tendencias de la salud están aumentando la conciencia entre los consumidores acerca de la ingesta de alimentos azucarados y bebidas que les estimula a cambiar sus preferencias hacia los productos con menos contenido de azúcar y calorías. Hoy en día, el uso de edulcorantes naturales en formulaciones de productos es cada vez más frecuente, siendo los extractos de stevia los más populares. El término stevia, usado para referirse a los glicósidos de esteviol (SGs), es una alternativa adecuada a los edulcorantes artificiales debido a su capacidad edulcorante, similar al aspartame, y estabilidad a bajo pH. Desafortunadamente, estos compuestos generan, además de su efecto edulcorante, atributos sensoriales no deseados tales como sabor amargo, metálico y regaliz, cuando se añaden a alimentos y bebidas. El objetivo del presente estudio fue seleccionar mezclas óptimas de edulcorantes naturales, no calóricos - el más alto dulzor y el menor amargor - para bebidas carbonatadas usando herramientas bioinformáticas y análisis sensorial. Construimos modelos tridimensionales del receptor de dulzor hT1R2-hT1R3, así como receptores de amargor hT2R4 y hT2R14, utilizando la estructura de referencia de GPCRs clase A y C. Una vez que se obtuvieron estos modelos, se predijeron los potenciales sitios de unión, así como las energías libres de unión asociadas, de edulcorantes naturales no calóricos - desde terpenoides glicosilados (GT) a proteínas dulces - mediante acoplamiento molecular. Las energías libres de unión calculadas se correlacionaron con el dulzor y amargor relativo previamente informados en la literatura. Los resultados de acoplamiento mostraron que la energía libre de unión (ΔGinteracción) entre el receptor hT1R2-hT1R3 y los edulcorantes pertenecientes a diferentes familias muestra una fuerte correlación con su intensidad de dulzor tanto para edulcorantes pequeños (r = -0.89) como proteínas dulces (r = -0.96). Mientras que el ΔGunión entre los receptores de amargor y SG se correlacionó negativamente con la intensidad de amargor de SG, tanto para hT2R4 (r = -0.95) como hT2R14 (r = -0.89).Además, el mecanismo de unión de algunos GTs, incluyendo los 10 compuestos activos de stevia, mediado por puentes de hidrógeno fue identificado tanto en los receptores de amargor como de dulzor, debido a los azúcares presentes en las estructuras de estos edulcorantes. Sin embargo, la afinidad de SG por los receptores de dulzor, así como sus diferencias en la intensidad de dulzor, se debe a sus propiedades físico-químicas, es decir, una estructura química que combina una plataforma hidrofóbica funcionalizada por un número de sitios de puentes de hidrógeno. Por el contrario, la afinidad por los receptores de amargor podría ser debido a las características estéricas de SG y su arquitectura de sitiode unión. Finalmente, seleccionamos mezclas óptimas de edulcorantes naturales no calóricos para bebidas carbonatadas mediante análisis sensorial. Para ello, determinamos el dulzor equivalente de sacarosa, stevia y tagatosa, así como las pruebas analíticas de diferentes productos, mediante panel sensorial entrenado y se calculó la ecuación canónica de Scheffé para amargor basada en el diseño simplex-lattice de tres componentes en la matriz de bebidas. Alternativamente, se aplicó un modelo de decisión multi-objetivo para identificar combinaciones óptimas de sacarosa, stevia y tagatosa basadas en las propiedades termodinámicas de las interacciones edulcorante-receptor y edulcorante-edulcorante. Las mezclas óptimas predichas fueron similares a las obtenidas a través de DOE y análisissensorial, demostrando la robustez del modelo. Por lo tanto, las combinaciones más adecuadas, dependiendo del equilibrio dulzor/amargor, contiene 23 - 39 g/L sacarosa, 0.19– 0.34 g/L stevia and 34 - 42 g/L tagatosa. Además, una reducción de casi 60% de sacarosa puede ser lograda usando tanto stevia como tagatosa, manteniendo baja la intensidad de amargor. Si se desea una reducción adicional, las mezclas ternarias con una alta proporción de tagatosa son una buena opción para mantener un sabor más similar al azúcar. Esto podría resultar en una reducción del 79% de las calorías totales en comparación con un refresco regular (sacarosa pura). En conjunto, los resultados de este estudio y las herramientas desarrolladas ayudarán a desarrollar nuevas mezclas de edulcorantes con otros edulcorantes naturales como LuoHan Guo o también a reducir otros atributos no deseados, además del amargor.
Oxygen management during alcoholic fermentation
(2013) Moenne Vargas, María Isabel; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Las adiciones de oxígeno son una práctica común durante el proceso de elaboración del vino, debido a que tienen un efecto positivo en la cinética de fermentación y la síntesis de biomasa, además de contribuir al color, estructura y aroma de los vinos tratados. A pesar de su importancia, la mayoría de las adiciones de oxígeno son realizadas de manera heurística, a través de remontajes basados sólo en el conocimiento de los enólogos, dificultándose así su manejo en términos de las cantidades exactas de oxígeno transferidas al mosto durante la fermentación. Por este motivo, es importante estimar la cantidad de oxígeno adicionado, ya que adiciones insuficientes de oxígeno no son efectivas, mientras que adiciones excesivas podrían generar defectos organolépticos, afectando drásticamente la calidad del vino final. Así, el manejo de la adición de oxígeno es crítica, tanto para determinar la cantidad adecuada de oxígeno a adicionar durante la elaboración del vino (dependiendo de los resultados deseados por el enólogo) o la dinámica de transferencia de oxígeno y su consumo, como para contar con herramientas que permitan regular precisamente las adiciones de oxígeno.
Physiology of oxygen consumption by an industrial strain of saccharomyces cerevisiae under enological fermentation conditions.
(2013) Orellana Acuña, Marcelo Andrés; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
Las adiciones discretas de oxígeno juegan un papel crítico en el proceso de fermentación del vino. Sin embargo, hasta ahora, no se han llevado a cabo estudios de biología de sistemas, acerca de cómo el oxígeno modifica el metabolismo de la levadura vínica bajo condiciones de fermentación vínica. Proponemos aquí la primera aproximación sistémica para el entendimiento cuantitativo del impacto del oxígeno sobre la fisiología de la levadura vínica, bajo condiciones enológicas. Para este fin, los efectos del oxígeno disuelto en el transcriptoma, fluxoma y metabóloma sobre la fisiología de la levadura vínica fueron evaluados. Simulamos el rango de concentraciones de oxígeno que se producen después de un remontaje enológico, burbujeando cultivos continuos limitados en nitrógeno con mezclas gaseosas oxígeno-nitrógeno, para alcanzar concentraciones crecientes de oxígeno en estado estacionario. Cuando el oxígeno disuelto aumenta desde 1.2 a 2.7 mM (20 ºC), el metabolismo de la levadura cambia desde totalmente fermentativo a mixto respiro-fermentativo. Esta transición se caracteriza por un cambio en la operación de ciclo del ácido tricarboxílico y el aumento del transporte de NADH desde el citosol a la mitocondria. Sin embargo, la producción fermentativa de etanol sigue siendo el principal sumidero del NADH citosólico para todas las condiciones con oxígeno, sugiriendo la limitación de la reoxidación mitocondrial de NADH como la principal causa del efecto Crabtree, en lugar de la represión por glucosa. Esto es reforzado por la inducción de varios genes respiratorios clave por oxígeno, a pesar de la alta concentración de azúcar.Por otro lado, simulamos las típicas operaciones enológicas de adición de oxígeno realizando un impulso de oxígeno puro por 30 segundos, en condiciones anaeróbicas, utilizando cultivos continuos limitados en nitrógeno. Genes respiratorios y de biosíntesis de ergosterol fueron inducidos después del impulso de oxígeno. Además, genes involucrados en remodelamiento de pared celular y estrés oxidativo entre otros, fueron significativamente inducidos y/o reprimidos por el impulso de oxígeno. Los cambios en la expresión de estos genes son respuestas coordinadas que comparten elementos comunes a nivel de regulación transcripcional. Los resultados de este estudio indican que la respiración mitocondrial es responsable de parte sustancial de la respuesta al oxígeno en células de levadura durante la fermentación alcohólica. Además, genes involucrados en consumo de prolina, remodelamiento de pared celular y estrés oxidativo fueron significativamente inducidos y/o reprimidos, tanto a corto como a largo plazo por oxígeno, destacando el papel dual del oxígeno en “crear o destruir vinos”. Estos hallazgos facilitaran el desarrollo de estrategias de adición de oxígeno para optimizar el desempeño de la levadura en fermentaciones industriales.

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