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C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
(2014) González Zúñiga, Marcelo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
La inhibición de la quinasa ABL al factor TFEB y promueve la limpieza celular en la enfermedad lisosomal de Niemann-Pick C
(2019) Contreras Soto, Pablo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los lisosomas son organelos celulares que juegan un rol fundamental en la homeostasis celular al estar involucrados en procesos tales como: la reparación de la membrana plasmática, la degradación y el reciclaje de nutrientes, el metabolismo de macromoléculas y la autofagia. Deficiencias en proteínas lisosomales generan la acumulación de diversos tipos de moléculas en este organelo y son la causa de diferentes enfermedades lisosomales, tales como Niemann-Pick tipo C (NPC), la cual se caracteriza por presentar acumulación de colesterol lisosomal debido a mutaciones en los genes que codifican para las proteínas NPC1 ó NPC2. Interesantemente, en el último tiempo se ha descrito al factor de transcripción EB (TFEB) como el regulador maestro de la biogénesis lisosomal y de la expresión de genes involucrados en la autofagia. La actividad de TFEB y su translocación al núcleo depende de su estado de fosforilación en las serinas 211 y 142, las que son fosforiladas principalmente por la serina/treonina quinasa mTORC1. En condiciones basales, TFEB está fosforilado en las serinas mencionadas anteriormente y se mantiene en el citoplasma debido a su acoplamiento a la chaperona citosólica 14-3-3. En nuestro laboratorio se ha descrito previamente la activación de la tirosina quinasa ABL en la enfermedad NPC. La inhibición de ABL usando Imatinib, un inhibidor específico de la quinasa, previene la muerte neuronal en el cerebelo, y promueve una mejora de las habilidades motoras y la sobrevida de los ratones modelo de la enfermedad. Adicionalmente, se ha descrito que el uso de inhibidores farmacológicos de ABL inducen el flujo autofágico y el incremento en la cantidad de lisosomas. Sin embargo, el mecanismo celular por el cual la inhibición de ABL estaría induciendo estos cambios aún se desconoce.Tomando en cuenta esta información y resultados preliminares, nos planteamos la siguiente hipótesis: “La señalización de ABL promueve la localización citoplasmática deTFEB inhibiendo la limpieza celular y contribuyendo a la patogenia de la enfermedad lisosomal de Niemann-Pick C”. Para corroborar nuestra hipótesis, primero evaluamos la translocación de TFEB al núcleo mediante la técnica de high-content screening utilizando distintos inhibidores de ABL. Encontramos que la inhibición de ABL mediante distintos inhibidores promueven la translocación de TFEB al núcleo. Encontramos los mismos resultados mediante fraccionamiento núcleo citoplasma, y al evaluar TFEB endógeno. Adicionalmente, al utilizar un siRNA contra ABL1 observamos el mismo fenómeno de translocación al núcleo y un incremento de la expresión de los genes blanco de TFEB. Estos resultados indican que la inhibición de ABL promueve la activación de TFEB. Luego, evaluamos procesos biólogicos descritos rio abajo de la activación de TFEB en condiciones de inhibición de ABL. Observamos que la inhibición de ABL incrementa el flujo autofágico en células H4 que sobreexpresan establemente el plásmido LC3-GFPmRFP. Además, la inhibición de ABL utilizando Imatinib o un siRNA contra ABL1, incrementó los niveles proteicos de los lisosomas, lo que fue evaluado siguiendo los niveles de LAMP1 y la tinción de lysotracker. Interesantemente, observamos que los lisosomas se acoplan a la membrana plasmática al inhibir ABL, sugiriendo un incremento en el proceso de exocitosis lisosomal. Estos resultados indican que el incremento tanto del flujo autofágico, la cantidad de lisosomas como la de exocitosis lisosomal, procesos regulados por la activación de TFEB, son eventos rio abajo de la inhibición ABL. Por otro lado, evaluamos si esta activación de TFEB por la inhibición de ABL era dependiente o independiente de mTORC1. Para ello, evaluamos los niveles de fosforilación de las serinas 142 y 211 de TFEB utilizando anticuerpos específicos para estas serinas fosforiladas. Encontramos que el inhibidor de ABL no produce cambios en los niveles de fosforilación de la serina 142, y si reduce los niveles en la serina 211 deTFEB. Evaluamos la actividad de mTORC1 analizando la fosforilación de proteínas blanco de mTORC1, y en forma coherente con los resultados anteriores observamos que inhibidores de ABL, Imatinib o Nilotinib, no generan cambios en la actividad de mTORC1. Estos resultados indican que la inhibición de ABL activa a TFEB independiente de la actividad mTORC1. Posteriormente, evaluamos si la tirosina quinasa ABL podría fosforilar en tirosina a TFEB. Mediante inmmuno precipitación de TFEB y un ensayo de fosforilación in vitro,encontramos que la actividad de ABL es suficiente para promover un incremento en los niveles de fosforilación en tirosina de TFEB. Por otro lado, encontramos mediante mutaciones sitio dirigidas de TFEB que la tirosina 173 es relevante para mantener a TFEB en el citoplasma e impacta en los niveles fosforilación en S211. Nuestros resultados muestran por primera vez que ABL fosforila a TFEB en tirosina y que estas fosforilaciones son relevantes para su localización citoplasmática. Debido a que ABL fosforila a TFEB en tirosina y su inhibición promueve su translocaciónal núcleo, quisimos evaluar si esta vía de señalización tendría un impacto en la limpieza celular, un fenómeno regulado por TFEB. En distintos modelos celulares en los cuales primero se promovió la acumulación de colesterol lisosomal, observamos que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular de este colesterol acumulado. Interesantemente,este fenómeno no ocurre al utilizar células nulas para TFEB, indicando que la inhibición de ABL promueve la limpieza celular a través de la activación de TFEB. Posteriormente, evaluamos si esta vía de señalización ABL/TFEB participa en la acumulación de colesterol lisosomal en modelos de la enfermedad lisosomal de NPC. Encontramos en fibroblastos de pacientes de NPC que la quinasa ABL está activa, y que su inhibición promueve tanto la reducción en la acumulación de colesterol como la translocación de TFEB al núcleo. Esto se correlacionó con un incremento en los niveles de lysotracker y Lamp1 y de la expresión de genes blanco de TFEB en fibroblastos de pacientes NPC tratados con Imatinib y Nilotinib.Finalmente, corroboramos mediante modelos in vivo de la enfermedad que la inhibición o ausencia de ABL promueve la reducción de acumulación de colesterol y la translocación de TFEB al núcleo en las neuronas de purkinje. En resumen, hemos encontrado una nueva vía de señalización que involucra a ABL y TFEB. La inhibición de ABL promueve la translocación de TFEB al núcleo, incrementando la expresión de genes lisosomales y promoviendo la limpieza celular de colesterol en modelos de la enfermedad de NPC. De esta manera, la inhibición de la vía de señalización ABL/TFEB emerge como un blanco terapéutico no sólo para NPC, sino que también para las diversas enfermedades en las que la función lisosomal se ve disminuida.
Modulación del procesamiento de la proteína precursora del amiloide por la tirosina quinasa C-ABL y su implicancia en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C /
(2016) Yáñez Henríquez, María José; Álvarez Rojas, Alejandra; Zanlungo Matsuhiro, Silvana; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) es un desorden hereditario autosómico recesivo causado por mutaciones en dos genes que codifican para las proteínas NPC1 y NPC2. Estas proteínas participan en el tráfico intracelular de lípidos y su deficiencia causa la acumulación de colesterol en los lisosomas. Sorpresivamente en distintas regiones del SNC de pacientes NPC, se han detectado aumentos del péptido β-amiloide (Aβ), el elemento patogénico causante de la pérdida sináptica y la muerte neuronal en la Enfermedad de Alzheimer (EA). Estudios in vitro e in vivo indican de que la pérdida de NPC1 conduce a un aumento significativo en los niveles de βCTF y sAPPβ. Resultados de nuestro laboratorio indican que la quinasa c-Abl se encuentra activada en la enfermedad de NPC. Además, c-Abl interactúa y fosforila la proteína precursora amiloide (APP), sin embargo, la relevancia de esta interacción no se ha definido aun. En este trabajo, se observó que la inhibición de c-Abl, mediante el uso de Imatinib un inhibidor específico de c-Abl o expresando un ARN interferente (shRNA) específico para c-Abl, reduce los niveles de Aβ y βCTF y aumenta los niveles de sAPPα en células deficientes de NPC1 que sobreexpresan APP. Consistentemente el tratamiento con Imatinib resultó en una disminución en el procesamiento amiloidogénico de APP en ratones nulos para NPC1. Por otra parte, también encontramos disminución de los niveles de βCTF en cultivos de neuronas corticales derivadas de ratones c-Ablfloxo/floxo Nestin Cre (neuronas nulas para c-Abl).Además, encontramos que c-Abl interactúa con APP y que el motivo -YENP- en la cola citoplásmica de APP es esencial para su interacción con c-Abl. Mediante el uso de imágenes de fluorescencia de vida media (FLIM), se observó que Imatinib redujo significativamente la interacción de APP con c-Abl. Sin embargo, más relevante fue que se observó que la inhibición de c-Abl reduce la interacción de APP con BACE1, lo que es consistente con que c-Abl potencia la interacción APP-BACE1 y promueve el procesamiento amiloidogénico de APP y la secreción de Aβ en modelos de NPC. En este trabajo, nosotros reportamos que específicamente la mutación Y682A afecta a la formación del complejo de APP con BACE1. Estos resultados dan nuevos antecedentes para comprender el papel desempeñado por c-Abl en su interacción con APP y en la progresión de la degeneración neuronal. Además, muestran el papel crucial que desempeña el residuo Tyr682 en el control del procesamiento de APP en las células.
Rol de la tirosina quinasa Abl1 en la activación de linfocitos B en respuesta al reconocimiento de antígenos
(2021) Valls Jiménez, Cristián; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los linfocitos B son un componente esencial del sistema inmunológico, los cuales reconocen antígenos de manera específica a través de receptores de membrana denominados BCR. Este reconocimiento desencadena procesos que culminan con la endocitosis del antígeno para posteriormente procesarlo y presentarlo a linfocitos T CD4+ . La interfaz entre linfocitos B y células presentadoras de antígenos que permite el reconocimiento y la endocitosis de antígenos es llamada sinapsis inmunológica (SI), y su formación y maduración son fundamentales para la activación del linfocito B. La conformación de la SI es orquestada mediante la reorganización del citoesqueleto, lo que permite la amplificación de la señalización del BCR y coordina procesos rio abajo del receptor. El reclutamiento lisosomal a la SI es uno de estos procesos y facilita la extracción e internalización de antígenos. Si bien se han identificado ciertos componentes de la vía de señalización del BCR, al igual que ciertos efectores del remodelamiento del citoesqueleto y otros procesos biológicos, la caracterización de intermediarios entre el receptor BCR y la activación de esos efectores, aún permanece sin ser identificada. Este trabajo aborda el rol de la tirosina quinasa Abl1 en la regulación de los procesos necesarios para procesar y presentar antígenos en respuesta a la activación del receptor BCR. Esto en base a antecedentes que han vinculado a Abl1 con funciones citoplasmáticas relacionadas a la adhesión, spreading y motilidad celular como también a la regulación de la localización y motilidad lisosomal; todos procesos necesarios para la activación de linfocitos B. Si bien se ha determinado que animales deficientes de Abl1 presentan alteraciones en la maduración de linfocitos B, su rol en linfocitos maduros permanece desconocido. A pesar de esto, se ha observado que la actividad quinasa de Abl1 aumenta en respuesta a la inducción del receptor BCR y que su deficiencia altera la endocitosis del BCR. Asimismo, de un punto de vista funcional se ha vinculado a Abl1 con el desarrollo y maduración del sistema inmunológico, pero su rol en linfocitos B maduros, no ha sido clarificado. Es por esto que primero se caracterizó la activación de Abl1 rio abajo del receptor BCR, luego se estudió si la regulación de Abl1 impacta procesos asociados a la activación de linfocitos B para finalmente analizar la activación de linfocitos B en un contexto donde previamente se ha descrito una actividad aberrante de Abl1. La activación de Abl1 en respuesta al reconocimiento de antígenos fue evaluada a través de modelos in vitro realizando incubación con anti-F(ab)2. Estos resultados confirmaron que Abl1 es activada en respuesta al cross-linking del receptor BCR. Además, revelaron que los niveles de ARN mensajero de Abl1 disminuyen significativamente a los 120 minutos post activación de linfocitos B. Luego, utilizando purificaciones de fracciones subcelulares y análisis por microscopia de fluorescencia, revelaron que Abl1 se encuentra principalmente en el compartimento citoplasmático, y que la activación de linfocitos B induce el reclutamiento de Abl1 hacia la sinapsis inmune. Estos resultados son fundamentales considerando que las funciones de Abl1 están altamente asociadas a su localización celular. Posteriormente, mediante el uso de un inhibidor y un activador farmacológico de Abl1 se evaluó el rol de esta quinasa en la activación de linfocitos B. Estos resultados indicaron que la extracción de antígenos, el spreading celular, y la polarización lisosomal y del centrosoma se ven alterados por el uso de moduladores farmacológicos de Abl1, sugiriendo un vínculo funcional de Abl1 y la activación de linfocitos B. Para confirmar estos resultados, se prosiguió evaluando en sistemas in vitro e ex vivo, si la modulación de Abl1 altera la capacidad de linfocitos B para presentar antígenos. Interesantemente estos resultados indicaron que Imatinib disminuye la capacidad de presentar antígenos ex vivo e in vitro, pero DPH tiene un efecto observable solo en condiciones in vivo. Estos resultados son relevantes dado que la capacidad de procesar y presentar antígenos se relaciona directamente con la activación de linfocitos B y su posterior transformación en células productoras de anticuerpos de alta afinidad; sugiriendo que la modulación de Abl1 inhibe la activación de estas células. Finalmente se estudió la biología de linfocitos B en una enfermedad denominada NiemannPick tipo C (NPC), la cual es clasificada como una enfermedad de depósito lisosomal. Pacientes y modelos NPC no presentan un fenotipo evidente de alteración en el sistema inmunológico adaptativo, sin embargo, se ha descrito que los linfocitos B periféricos presentan acumulación de lípidos en endosomas tardíos/lisosomas homologando lo que ocurre en el sistema nervioso central. Utilizando linfocitos B derivados de bazos de animales deficientes de NPC, se evaluó la capacidad de presentar antígenos en donde se evidencio que células NPC -/- presentan una disminución en la capacidad de presentar antígenos, avalando el estudio de la activación de linfocitos B en este contexto. Dado que no se registran trabajos evaluando la biología de linfocitos B en modelos NPC, proseguimos con la caracterización de un modelo farmacológico de acumulación de lípido en estas células, para esto se utilizó el fármaco U18666A Este trabajo presenta evidencia de la dependencia de Abl1 en el procesamiento y presentación de antígenos en respuesta a su reconocimiento a través del BCR. Además, sugiere que los moduladores farmacológicos de Abl1 presentan actividad inmuoreguladora a través de la actividad de linfocitos B y no linfocitos T, lo cual no había sido descrito hasta el momento. Por último, esta tesis demuestra que modelos de la enfermedad de Niemann-pick tipo C poseen alteraciones en la activación de linfocitos B, y que el uso de la droga U186666A es un buen modelo farmacológico para continuar y profundizar su estudio.
Role of Abl1 kinase in axon initial segment disassembly and its consequences on axonal trafficking in Alzheimer’s disease.
(2024) Stuardo Castillo, Nicolás Gabriel; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Axon initial segment disassembly has recently begun to be appreciated as an important event in Alzheimer’s disease pathology as it directly impacts neuronal compartmentalization, leading to pathological processes like tau missorting. However, the molecular mechanisms that underlie the collapse of the axon initial segment scaffold are incompletely understood. Our lab has previously shown that Abl1 kinase, a non-receptor tyrosine kinase with multiple functions, becomes aberrantly activated in Alzheimer’s disease and promotes multiple deleterious cellular processes including dendritic spine collapse, tau hyperphosphorylation, neuronal apoptosis, among others. Given the important role of Abl1 in Alzheimer’s disease pathology and its emerging role in tau pathology, we set out to evaluate whether it could participate directly in axon initial segment collapse. Our results show that inhibition of Abl1 prevents amyloid-β fibril–promoted axon initial segment collapse, and conversely, that Abl1 allosteric activation promotes loss of Ankyrin G clustering. Through cytosolic extraction experiments, we show that active Abl1 associates to the axon initial segment scaffold, and that this association increases in response to amyloid-β fibril treatment. Furthermore, through expansion microscopy experiments we show that Abl1 can be found in the axon initial segment in vivo and in vitro. We then evaluated the effects of Abl1 activation on the axon initial segment actin cytoskeleton and found that it promotes a decrease in actin patch area and a generalized decrease in phalloidin stain intensity. In order to further our understanding of the underlying molecular mechanism, we evaluated the participation of MICAL3, a known AIS actin patch depolymerizing protein and Abl1 interactor, in the process of actin patch loss. Interestingly, we find that Abl1 appears to recruit MICAL3 to actin patches and that silencing MICAL3 expression with a shRNA precludes the actin patch disassembly induced by Abl1 activation, shedding light on a possible mechanism of AIS actin cytoskeleton disruption by Abl1. Finally, we evaluated 2 different cargoes that have been previously shown to depend on axon initial segment integrity for its correct compartmentalization: Rab11, a somatodendritic protein, and tau, an axonal protein. Strikingly, we find that Rab11 missorts into the axon, and tau missorts into the somatodendritic compartment in response to Abl1 activation, demonstrating a bidirectional failure in AIS barrier function. Taken together, our results show that Abl1 plays an important role in AIS destabilization and that this has important consequences in terms of protein compartmentalization, which are relevant processes in Alzheimer’s disease pathology.
Role of the non-receptor tyrosine kinase c-Abl in Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)-induced dendritic arborization inhippocampal neurons
(2021) Chandía Cristi, América Valeska; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El crecimiento y la ramificación dendrítica son procesos esenciales para establecer una conectividad neuronal adecuada. El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) induce la activación del receptor TrkB y sus vías de señalización rio abajo, MAPK, PI3K y PLC-γ, lo que conduce a la supervivencia de las neuronas, el crecimiento del árbol dendrítico y plasticidad sináptica. Antecedentes han demostrado que la regulación del endosoma de señalización de TrkB es necesaria para la formación de neuritas y la arborización dendrítica, sin embargo, el mecanismo aún no se ha dilucidado completamente. La tirosina quinasa no receptor, c-Abl, modifica la dinámica del citoesqueleto, regula los receptores de tirosina quinasa y participa de la morfogénesis neuronal. Sorprendentemente, observamos que la promoción de la complejidad de la arborización dendrítica inducida por BDNF no ocurre en las neuronas del hipocampo tratadas con diferentes inhibidores de tirosina quinasa c-Abl, Imatinib y GNF2. Además, usando un shRNA contra c-Abl y neuronas de embriones nulos de c-Abl, confirmamos que c-Abl, es necesario para la arborización dendrítica inducida por BDNF. Curiosamente, tras la activación de TrkB por BDNF, c-Abl se activa e interactúa con TrkB, lo que sugiere que podría ser una nueva señalización dependiente de BDNF-TrkB. Confirmamos que la actividad de TrkB es necesaria para la activación de c-Abl inducida por BDNF, pero la señalización de MAPK, PI3K y PLC-γ no están implicadas, lo que sugiere que c-Abl es una vía independiente corriente abajo de TrkB. Además, mediante biotinilación de la superficie de la membrana, observamos que la inhibición de la actividad de c-Abl aumenta la disponibilidad de TrkB en la membrana sin afectar la endocitosis dependiente de BDNF del receptor o su localización lisosómica. También observamos que el BDNF indujo un aumento de las vías clásicas de TrkB corriente abajo como MAPK y PI3K y no se vio afectado significativamente por la inhibición o ausencia de c-Abl. Sin embargo, la ausencia de c-Abl disminuye la velocidad vesicular retrógrada del receptor TrkB y, por el contrario, la sobreexpresión de un c-Abl-GFP aumenta la velocidad vesicular retrógrada del receptor. Juntos, nuestros resultados sugieren que la activación de c-Abl dependiente de BDNF / TrkB es un mecanismo novedoso y esencial para que la señalización de TrkB ejecute eficazmente sus efectos sobre la arborización dendrítica. Probablemente c-Abl podría estar contribuyendo sobre vesículas activas de TrkB que viajan al soma.
La señalización de la quinasa Abl1 restringe la expresión de un programa de genes sinápticos relacionado con la memoria y el aprendizaje.
(2019) González Martín, Adrián; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Mediante la memoria y el aprendizaje somos capaces de adquirir, almacenar y recuperar nueva información a lo largo de nuestra vida. Hoy se sabe que para que se forme la memoria es necesaria la modificación de la comunicación entre las neuronas, bien remodelando las espinas existentes o formando nuevas espinas. Para ello, se requiere una regulación tanto a nivel proteico como a nivel genético. Actualmente, se conocen factores de transcripción muy ligados a los procesos de memoria y aprendizaje, como; CREB, MEF2, Npas4 o SRF, entre otros. Además, ha tomado gran relevancia la regulación génica a través de modificaciones epigenéticas, llevadas a cabo, principalmente, por las enzimas HAT y HDAC. La actividad de HDAC2, por ejemplo, regula negativamente la formación de memoria y la plasticidad sináptica. Nosotros hemos descrito que la quinasa ABL1, es capaz de regular factores de transcripción como p73 o TFEB, así como a la HDAC2. La activación de esta última, por ABL1, reprime la expresión de genes sinápticos, como; la sinaptofisina, la sinaptotagmina o subunidades de los AMPAR y NMDAR. Además, el uso de Imatinib para inhibir la activación de ABL1, puede revertir la activación de la HDAC2 y, por tanto, permitir la expresión de genes fundamentales para la comunicación sináptica. A pesar de estos nuevos conocimientos, se desconoce el grupo de genes que se están regulando y que pueden determinar la correcta formación y mantenimiento de la memoria. Basándonos en los antecedentes presentados, nos planteamos la siguiente hipótesis: “La ausencia de ABL1 mejora la memoria y el aprendizaje regulando la expresión de genes involucrados en la plasticidad sináptica”. Para comprobar nuestra hipótesis, primero evaluamos in vivo, si la ausencia de ABL1 en el SNC tenía efectos cognitivos. Para ello, realizamos los tests de MWM, BM y NOR, que evalúan memoria y aprendizaje dependiente del hipocampo. Observamos que los ratones nulos de ABL1 tenían un aprendizaje más rápido y una mayor consolidación de la memoria que los controles. Lo que indicaría que ABL1 participa en la regulación de ambos procesos. A continuación, evaluamos si ABL1 estaría regulando la expresión de genes involucrados con los cambios cognitivos. Así, secuenciamos el RNA hipocampal de ratones nulos de ABL1 y sus respectivos controles, en ambos casos en estado basal y tras un entrenamiento de aprendizaje. Los resultados mostraron que los ratones nulos de ABL1 con aprendizaje presentaban un mayor número de genes con expresión diferencial respecto a los controles durante el aprendizaje que durante el estado basal, por lo que el efecto de ABL1 era debido al aprendizaje. Además, nuestros análisis determinaron que de los genes con una sobreexpresión diferencial por aprendizaje, casi dos tercios pertenecían a los ratones nulos de ABL1, los cuales pertenecen a ontologías relacionadas con la plasticidad sináptica y la regulación del citoesqueleto. Por otro lado, confirmamos mediante RT-qPCR la expresión diferencial de algunos de los genes relacionados con la morfología y plasticidad sináptica. Evaluamos si también había cambios en los niveles proteicos, de dos de los genes seleccionamos, Atad1 y Actr2 que tienen un papel muy importante en la plasticidad funcional y morfológica de las espinas, respectivamente. Ambas proteínas mostraron un aumento en los ratones nulos de ABL1 tras el aprendizaje. Para analizar in vitro los resultados obtenidos, utilizamos cultivos neuronales. Tras inhibir la activación de ABL1 con Imatinib, se hizo un estímulo químico de LTD o LTP para evaluar tanto los niveles de transcrito como proteicos de Arp2 y Thorase. En ambos casos aumentaron significativamente tras la generación de un LTP. Del mismo modo, la inhibición de ABL1 mediante el uso de su shRNA nos permitió observar como la polimerización del citoesqueleto de actina, controlada principalmente por Arp2, estaba siendo incrementada tras el LTP con respecto al control sc-shRNA. Por último, evaluamos si, según las ontologías enriquecidas en nuestro análisis, había cambios en las espinas de los ratones sometidos a aprendizaje. Mediante la tinción de Golgi-Cox pudimos clasificar y cuantificar espinas individuales, observando como la ausencia de ABL1 aumentaba su densidad y las de tipos más maduros tras el aprendizaje. Estas observaciones se correlacionan con sinapsis más estables y eficaces, requisitos indispensables para la formación de la memoria a largo plazo. Todos estos resultados indican que ABL1 esta jugando un rol determinante en los procesos de memoria y aprendizaje, regulando la expresión de genes sinápticos y de remodelación del citoesqueleto, reflejándose en la morfología y densidad de las espinas de los ratones nulos para ABL1 tras el aprendizaje. Además, la inhibición farmacológica de ABL1 aparece como una posible vía para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que involucren deterioro cognitivo.

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