Aumento de la termoestabilidad de una xilanasa activa en frío mediante ingeniería de proteínas.
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2020
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Abstract
Las enzimas son biocatalizadores biodegradables, no tóxicos, eficientes y selectivos, lo que le permite posicionarse como una alternativa más ecológica y sustentable a la catálisis química tradicional. Existe un grupo de enzimas denominadas enzimas activas a bajas temperaturas, las cuales son particularmente atractivas industrialmente, dado que pueden disminuir los requerimientos energéticos en los procesos industriales, reducir los riesgos de contaminación y la generación de reacciones químicas indeseables que ocurren a temperaturas más elevadas. No obstante, este tipo de enzimas generalmente presentan una baja termoestabilidad, reduciendo sus posibles usos a nivel industrial. Esto ha motivado el desarrollo de diversas técnicas de ingeniería de proteínas con el fin de estabilizar su estructura proteica. Un grupo particular de enzimas que son ampliamente utilizadas en la industria corresponden a las xilanasas, las cuales catalizan la hidrólisis de xilano, uno de los componentes principales de las paredes celulares de las plantas y, por lo tanto, poseen aplicaciones en diferentes sectores incluyendo la alimentación animal y la producción de azúcares bioactivos conocidos como xilo-oligosacáridos (XOS). El objetivo de este estudio fue aumentar la termoestabilidad de la xilanasa XyL-L, aislada desde la bacteria antártica Psychrobacter sp, mediante el uso de técnicas de ingeniería de proteínas sin sacrificar su actividad a bajas temperaturas. Primero se implementaron distintas estrategias para aumentar los niveles de expresión de XyL-L, dado a su escasa producción en los sistemas convencionales. La combinación de estrategias permitió obtener niveles de expresión adecuados para la posterior caracterización enzimática de XyL-L y las variantes generadas. Se utilizaron 2 estrategias de ingeniería de proteínas en búsqueda de mejorar la termoestabilidad de XyL-L, las cuales corresponden a la ingeniería de dominios y la ingeniería de loops. Para la ingeniería de dominios se diseñaron 3 variantes de XyL-L truncadas de sus dominios accesorios, denominados módulos de unión a carbohidratos o CBM. Dos de éstas variantes presentaron mayor termoestabilidad, la variante ΔCBM4, a la que se le ha delecionado el dominio CBM4 y su linker (L1), y la variante ΔCBM22 a la que se le quitó el dominio CBM22 y su linker (L2). No obstante, la variante ΔCBM22 mostró la mayor mejora en la termoestabilidad, con un aumento de 10 veces en la vida media a 40°C. Los parámetros termodinámicos indicaron que la mayor fuerza que condujo a la estabilización de ΔCBM22 fue una reducción de 7 veces en la diferencia entrópica (ΔS#IN). Los resultados de análisis de secuencia revelaron una alta proporción de residuos promotores del desorden en el linker L2. Además, se predijo una región intrínsecamente desordenada (IDR) que abarca el linker L2 y los primeros residuos del dominio CBM22. A raíz de estos hallazgos se analizaron otras enzimas multi-dominios a las cuales se les cortó al menos un dominio CBM, encontrándose que en aquellas enzimas que presentaron una región IDR en el linker o en el dominio cortado evidenciaron un aumento de termoestabilidad luego de la deleción. A raíz de estos resultados se postula que la presencia o ausencia de regiones IDR puede explicar el efecto variable observado luego de la deleción de un dominio accesorio. También es posible concluir que en el caso específico de XyL-L, fue posible obtener una variante con una mejora significativa en la termoestabilidad, la cual corresponde a la variante ΔCBM22. En tanto, en la ingeniería de loops se buscó rigidizar 2 loops del dominio catalítico mediante el acortamiento secuencial de las regiones más expuestas al solvente. Se generaron 3 variantes por cada loop con una deleción de 3, 5 y 7 residuos, no obstante, todas las variantes generadas presentaron una menor termoestabilidad que XyL-L. Se concluye, que la estrategia de ingeniería de loops no fue efectiva en la búsqueda de mejorar la termoestabilidad de XyL-L, lo cual puede deberse a un limitado conocimiento de la estructura del dominio catalítico que pudo haber influido en la selección de los sitios a cortar. El siguiente paso fue evaluar los efectos en la actividad en la variante que presentó la mayor termoestabilidad (ΔCBM22). Los resultados indicaron que ΔCBM22 no presentó cambios en la temperatura óptima (35°C) y mantuvo su actividad a bajas temperaturas, además ΔCBM22 mostró mejoras en la eficiencia catalítica. A raíz de estos resultados se concluye que la variante ΔCBM22, junto con generar una mejora en la termoestabilidad también generó una mejora en la eficiencia catalítica sobre sustratos solubles, manteniendo su actividad a bajas temperaturas. El último paso fue comparar el perfil de XOS producidos por XyL-L con las variantes de dominio, encontrándose diferencias en los XOS producidos a partir de xilano soluble. Los resultados sugieren que la presencia de los dominios CBMs favorecen la actividad sobre XOS de bajo tamaño molecular en XyL-L y que la diferencia del perfil de XOS generados entre las variantes están relacionados a las distintas afinidades por estos XOS. Además, fue posible evidenciar actividad transglicosilasa en XyL-L y las variantes de dominio. De acuerdo a los resultados obtenidos concluimos que fue posible obtener variantes de XyL-L con termoestabilidad mejorada, mediante el uso herramientas de la ingeniería de proteínas sin afectar su eficiencia catalítica y manteniendo su actividad a bajas temperaturas. Se proyecta en el futuro generar nuevas variantes a partir de la información obtenida de la ingeniería de dominios y obtener información estructural que permita realizar técnicas de diseño racional.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias de la Ingeniería)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2020