Sustratos de la PKA en el tráfico endocítico del EGFR y su importancia en cáncer
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2019
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El tráfico endocítico es crucial en la regulación de la función del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR), el cual regula procesos de proliferación, migración y sobrevida y su influencia se encuentra frecuentemente exagerada en cánceres de origen epitelial (carcinomas). En nuestro laboratorio hemos descubierto una nueva vía de regulación de la endocitosis del EGFR que podría utilizarse para contrarrestar rasgos tumorales dependientes de la acción oncogénica de este receptor. Aumentos del ácido fosfatídico (PA), mediante drogas que inhiben las enzimas fosfatidasas (PAPs), llevan a activación de fosfodiesterasas tipo 4 (PDE4), con la consiguiente disminución de los niveles de AMPc y de la actividad de la proteína quinasa A (PKA). Esta vía PA/PDE4/PKA puede estimularse farmacológicamente por D-Propranolol llevando a una internalización del EGFR independiente de ligando, con efectos deletéreos para células tumorales dependientes del EGFR. El D-Propranolol es un enantiómero no beta-bloqueante del Propranolol que podría utilizarse en altas dosis in vivo para contrarrestar el crecimiento tumoral. El mecanismo por el cual esta vía PA/PDE4/PKA lleva a internalización del EGFR es desconocido, pero debe involucrar sustratos de la PKA que sirvan de sensores de la actividad de esta enzima y la relacionen con el tráfico endocítico. En esta tesis propusimos identificar potenciales sustratos de la PKA en la vía endocítica regulada por PA/PDE4/PKA, centrándonos en proteínas importantes en cáncer. En base a un análisis bioinformático y a los efectos de mutaciones puntuales en p53 que aumentan el reciclaje de EGFR e integrinas planteamos la siguiente hipótesis: “La endocitosis del EGFR inducido por D-Propranolol en células tumorales involucra las proteínas PAK4, GEF-H1 y RCP en presencia o ausencia de mutaciones puntuales en p53”. El objetivo general es explorar el mecanismo de endocitosis del EGFR inducido por la vía PA/PDE4/PKA y sus efectos funcionales. Los objetivos específicos son: 1) Determinar si PKA4, GEF-H1 y RCP son blancos de fosforilación río abajo de la PKA en la vía PA/PDE4/PKA; 2) Definir el rol de PAK4, GEF-H1 y RCP en el tráfico endocítico del EGFR inducido por la vía PA/PDE4/PKA y sus implicaciones funcionales y 3) Definir el efecto de estimular la vía PA/PDE4/PKA en células tumorales que expresan mutaciones puntuales en p53. Metodología: Utilizamos D-propranolol para gatillar la vía PA/PDE4/PKA o H89 para inhibir directamente a la PKA en experimentos de inmunoprecipitación para detectar interacciones relevantes, inmunofluorescencia para analizar colocalizaciones y silenciamiento o sobreexpresión de las proteínas en estudio en células HeLa. Como modelos de células que expresan mutaciones de p53 utilizamos células tumorales de pulmón EIH1299, transfectadas con vectores inducibles para la expresión de p53 R273H, y células G-415 de cáncer de vesícula biliar en las cuales encontramos la mutación puntual p53 R282W.Resultados. 1) Análisis bioinformáticos revelan a la PAK4, GEF-H1 y RCP como sustratos de la PKA con funciones conocidas en el citoesqueleto (PAK4 y GEF-H1) o en reciclaje (RCP). Análisis proteómicos y de ontología genética indicaron que el interactoma del EGFR regulado por la PKA involucra principalmente componentes del citoesqueleto. 2) PAK4 y GEF-H1 son sustratos de la PKA que funcionan en el reciclaje del EGFR a través del citoesqueleto en la vía PA/PDE4/PKA; 3) RCP es un sustrato de la PKA que interactúa con EGFR, α5β1 integrina y Rab11 de manera regulada por la vía PA/PDE4/PKA; 4) RCP está involucrado en la endocitosis del EGFR inducida por ligando, pero no por la vía PA/PDE4/PKA; 5) RCP no es necesaria para la acumulación intracelular del EGFR inducido por la vía PA/PDE4/PKA y tampoco para su retorno desde endosomas de reciclaje en células HeLa. Sin embargo, como la activación de la vía PA/PDE4/PKA aumenta la interacción y la colocalización endosomal de RCP y EGFR, es posible que este complejo participe en el mecanismo de retención del EGFR en endosomas de reciclaje perinuclear, donde se esperaría que actúe la Rab11. En nuestro enfoque experimental de silenciar RCP por CRISPR/Cas9 podría llevar a algún tipo de compensación por otras proteínas, incluyendo la PAK4 y la GEF-H1. Experimentos agudos de silenciamiento podrían revelar una función más concordante con el efecto de aumento de la interacción y colocalización entre RCP y EGFR. Es importante definir en el futuro si los endosomas donde se acumula el EGFR bajo la influencia de la vía PA/PDE4/PKA son los mismos en células que expresan o que no expresan RCP 6) D-Propranolol induce internalización del EGFR y contraresta las propiedades invasivas y proliferativas dependientes de mutaciones p53. Conclusiones. 1) PAK4, GEF-H1 y RCP son componentes río abajo de la vía PA/PDE4/PKA y conectan ya sea al citoesqueleto (PAK4 y GEF-H1) o la maquinaria de reciclaje (RCP) con el tráfico endocítico del EGFR. 2) La interacción del EGFR con RCP, α5β1 integrina, Rab11 y EphA2 es regulada por la actividad de la PKA. 3) La activación de la vía PA/PDE4/PKA podría ser efectiva como estrategia anti-tumoral en cánceres irrespectivamente de la presencia de mutaciones puntuales de p53.
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Tesis (Doctor en Ciencias Médicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019