Browsing by Author "Ramírez Sarmiento, César Antonio"

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    Alteración del período circadiano del reloj proteico KaiABC mediante diseño racional del estado de transición de replegamiento de la proteína metamórfica KaiB
    (2023) Retamal Farfán, Ignacio Andrés; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Rivera Valdés, Maira; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La proteína metamórfica KaiB regula el reloj biológico de cianobacterias KaiABC mediante la interconversión de su estructura. Este tipo de proteínas pueden adoptar más de un estado termodinámicamente estable y responsable de su función biológica, lo que desafía a la clásica noción de “una secuencia - una estructura - una función”. Durante el día, KaiB forma un homotetrámero (gsKaiB), mientras que por la noche se transforma a un monómero (fsKaiB). Este cambio en el estado oligomérico va acompañado con cambios en su estructura secundaria y terciaria en su mitad C-terminal. Previo a este trabajo, el mecanismo de metamorfosis y los residuos relevantes para la formación de la transición metamórfica eran desconocidos. En la presente tesis, mediante simulaciones de dinámica molecular con modelos basados en estructura (SBMs) de doble cuenca, se dilucidan los estados de transición y el mecanismo de metamorfosis de KaiB, el cual sigue como ruta gs2⇄2gs⇄2fs, con la disociación del dímero de gs como el paso limitante del proceso. Utilizando criterios de probabilidad de formación de contactos nativos y cambios en frustración energética local, se identificaron 5 residuos relevantes para la formación del estado de transición de la interconversión monomérica gs⇄fs (R5, T18, R23, K37 y K58). A partir de los análisis de frustración energética, se propusieron mutantes que estabilizaran a estos residuos en el estado de transición, las que se evaluaron en fsKaiB, gsKaiB y el complejo fsKaiB-KaiC. Apuntando al objetivo de alterar el período del reloj mediante la modulación cinética de la transformación de KaiB, se consideraron aquellas mutantes que minimizaran la frustración energética en las estructuras del estado de transición y estados finales, las cuales fueron T18C, K37I y K37V. Adicionalmente, se ha reportado que al mutar el residuo arginina 23 por cisteína (R23C) cambia el periodo del reloj a 26 h, lo que probablemente se deba a su interacción con KaiC. Esta observación se condice con nuestros análisis de frustración, en donde se observa que la mutante R23C disminuye la frustración local del residuo en su estado fsKaiB-KaiC. Es por esto que se realizaron experimentos preliminares reconstituyendo el reloj KaiABC silvestre in vitro, que se complementaron con el diseño de un sistema de tomas de muestra automatizado, logrando observar la oscilación del estado de fosforilación de KaiC con un período de 24 h. En base a los resultados obtenidos se proyecta que el uso de herramientas bioinformáticas, como SBMs duales y análisis de frustración energética, son relevantes para comprender el mecanismo de transformación de proteínas metamórficas oligoméricas e incluso podrían ser usadas en el diseño de relojes biológicos sintéticos.
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    Bio-click chemistry: a bridge between biocatalysis and click chemistry
    (2022) Rodríguez Sánchez, Diego Fernando; Moglie, Yanina; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Singh, Sachin Kumar; Dua, Kamal; Zacconi, Flavia C. M.
    The fields of click chemistry and biocatalysis have rapidly grown over the last two decades. The development of robust and active biocatalysts and the widespread use of straightforward click reactions led to significant interactions between these two fields. Therefore the name bio-click chemistry seems to be an accurate definition of chemoenzymatic reactions cooperating with click transformations. Bio-click chemistry can be understood as the approach towards molecules of high-value using a green and sustainable approach by exploiting the potential of biocatalytic enzyme activity combined with the reliable nature of click reactions. This review summarizes the principal bio-click chemistry reactions reported over the last two decades, with a special emphasis on small molecules. Contributions to the field of bio-click chemistry are manifold, but the synthesis of chiral molecules with applications in medicinal chemistry and sustainable syntheses will be especially highlighted.
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    Design of a metamorphic protein from first principles
    (2023) Galaz Davison, Pablo Antonio; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La mayoría de las secuencias de proteínas naturales se pliegan en una estructura tridimensional definida, cuya química y dinámica regula las reacciones y procesos de la materia viva. No obstante, se estima que entre 0,5 y 4% de las proteínas con estructuras resueltas experimentalmente tienen algún grado de comportamiento metamórfico. Esta es una característica de algunas proteínas que han evolucionado para tener más de una estructura, cambiando reversiblemente entre ellas en respuesta a cambios en su entorno químico. El ejemplo más notable de una proteína metamórfica es RfaH. Esta proteína de dos dominios regula la expresión de factores de virulencia en Enterobacteriaceae. En su estado basal, sus dominios N-terminal (NTD) y C-terminal (CTD) interactúan estrechamente. Los operones de factores de virulencia contienen una secuencia de ADN llamada ops, que detiene la transcripción de la ARN polimerasa (RNAP) y sirve como una señal química para reclutar RfaH, uniéndose a RNAP al disociar sus dominios. Los dominios RfaH ahora separados se comportan de manera diferente: el NTD se une a RNAP para aumentar la procesividad de la transcripción, mientras que el CTD cambia de una horquilla α-helicoidal a un barril β, estructuralmente similar al observado en el parálogo NusG, mediante el cual RfaH recluta al ribosoma para acoplar la transcripción y traducción de genes que, de otro modo, serían pobremente expresados. Descifrar las señales fisicoquímicas que permiten el cambio estructural de RfaH es crucial para comprender su mecanismo molecular. En esta tesis, mostramos que el CTD metamórfico alberga regiones locales de estabilidad diferencial hacia cada estructura, con la punta de la horquilla α-helicoidal estabilizando el estado basal a través de contactos interdominio. El NTD y el CTD βplegado son menos estables que RfaH α-plegado y pueblan un intermediario β-plegado estabilizado por el NTD antes de replegarse en el estado basal. Por último, señales coevolutivas nativas y no nativas, derivadas del análisis de miles de secuencias de RfaH, son suficientes para codificar ambas estructuras, encontrando contactos interdominio e intrahelicoidales que estabilizan el CTD α-plegado y muestran evidencia directa de esta estructura secundaria en RfaH. Estos resultados son relevantes para comprender el mecanismo de cambio de pliegue de RfaH y para postular los principios que rigen a las proteínas metamórficas.
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    Discovery of New Phenylacetone Monooxygenase Variants for the Development of Substituted Indigoids through Biocatalysis
    (2022) Núñez Navarro, Nicolás Ernesto; Salazar Muñoz, Javier Alonso; Castillo Suzarte, Francisco Javier; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Poblete Castro, Ignacio; Zacconi, Flavia C. M.; Parra, Loreto
    Indigoids are natural pigments obtained from plants by ancient cultures. Romans used them mainly as dyes, whereas Asian cultures applied these compounds as treatment agents for several diseases. In the modern era, the chemical industry has made it possible to identify and develop synthetic routes to obtain them from petroleum derivatives. However, these processes require high temperatures and pressures and large amounts of solvents, acids, and alkali agents. Thus, enzyme engineering and the development of bacteria as whole-cell biocatalysts emerges as a promising green alternative to avoid the use of these hazardous materials and consequently prevent toxic waste generation. In this research, we obtained two novel variants of phenylacetone monooxygenase (PAMO) by iterative saturation mutagenesis. Heterologous expression of these two enzymes, called PAMOHPCD and PAMOHPED, in E. coli was serendipitously found to produce indigoids. These interesting results encourage us to characterize the thermal stability and enzyme kinetics of these new variants and to evaluate indigo and indirubin production in a whole-cell system by HPLC. The highest yields were obtained with PAMOHPCD supplemented with L-tryptophan, producing ~3000 mg/L indigo and ~130.0 mg/L indirubin. Additionally, both enzymes could oxidize and produce several indigo derivatives from substituted indoles, with PAMOHPCD being able to produce the well-known Tyrian purple. Our results indicate that the PAMO variants described herein have potential application in the textile, pharmaceutics, and semiconductors industries, prompting the use of environmentally friendly strategies to obtain a diverse variety of indigoids.
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    Herramientas de libre acceso para la detección de secuencias específicas en ADN ambiental
    (2023) Matute Torres, Tamara Francisca; Federici, Fernán; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La conservación de los recursos naturales y la diversidad biológica representa un desafío urgente a abordar a nivel mundial. Dentro de los grandes problemas que afectan actualmente a la biodiversidad está la presencia de especies exóticas invasoras (EEI) en los ecosistemas naturales. Este factor no solo determina un gran deterioro en la diversidad biológica y daño ecosistémico, sino que también se traduce en importantes pérdidas económicas y amenazas zoonóticas. Dado que las posibilidades de controlar una especie invasora una vez que ha colonizado un lugar se vuelven escasas, las recomendaciones a nivel internacional apuntan a estrategias de monitoreo temprano como la opción más económica y efectiva que permite ejecutar planes anticipados de prevención. Sin embargo, una de las principales barreras en el control y contención de las EEI es la inexistencia de sistemas de monitoreo adecuados y la dificultad de movilizar recursos para su ejecución. Es por esto, que urge la necesidad de crear sistemas de monitoreo económicos, rápidos y eficientes que permitan una temprana identificación de EEI en terreno. En este trabajo se presenta el desarrollo de recursos biológicos, hardware y software de libre acceso para el monitoreo de ADN ambiental en ecosistemas hídricos, enfocado principalmente en la detección de Castor Canadensis. Esto incluye el desarrollo de herramientas moleculares accesibles localmente, la elaboración y optimización de reacciones LAMP caseras y a bajo costo, la selección de targets y diseño de primers específicos para mejorar el desempeño de las reacciones con muestras ambientales, la validación de ensayos LAMP para la detección de Castor Canadensis, y la elaboración de equipamiento y software de libre acceso para el registro y análisis de señales fluorescentes. Los resultados de esta tesis demuestran la detección molecular de ADN de Castor Canadensis a bajo costo y de manera descentralizada gracias a los insumos producidos de manera local y el desarrollo de herramientas de libre acceso de hardware y software. Además, el desempeño de estas reacciones fue comparable con los kits comerciales en términos de sensibilidad y especificidad, constituyéndose como una alternativa más económica para el diagnóstico molecular. Se espera continuar con la optimización y evaluación, tanto de las reacciones LAMP como el equipamiento, con muestras ambientales, lo que podría permitir avanzar en xii el desarrollo y aplicabilidad de las técnicas de detección molecular en terreno, la vigilancia epidemiológica y/o la conservación de especies.
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    Ingeniería de patrones autoorganizados complejos en poblaciones celulares creciendo en superficie
    (2023) Núñez Quijada, Isaac Natán; Federici, Fernán; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La organización espacial de tipos celulares coordinados desempeña un papel crítico en el funcionamiento de los sistemas biológicos y la aparición de propiedades emergentes de mayor nivel. Esta estructuración ocurre a través de procesos que operan a diferentes escalas, involucrando la integración de señales locales y globales que establecen una relación entre el nivel micro y macro. Las aproximaciones clásicas para comprender la organización multicelular están restringidas a la capacidad de análisis de los sistemas biológicos existentes en la naturaleza. Sin embargo, debido al elevado número de componentes y la complejidad de sus interacciones, resulta difícil establecer reglas generales que gobiernen este proceso. La biología sintética plantea un enfoque alternativo para abordar el estudio de la organización multicelular. Este enfoque busca explorar los principios y mecanismos fundamentales de manera constructiva (bottom-up) mediante la creación y estudio de sistemas artificiales mínimos y altamente trazables. En este trabajo se presenta el desarrollo de un sistema modular, tanto a nivel de hardware como biológico, para el estudio y control de la organización de estados en arreglos celulares que surge de la integración de procesos biológicos de interacción local y global. Para ello, se estableció el modelo de Ising como marco conceptual capaz de representar estos procesos, y la utilización de colonias de E.coli como arreglos celulares de fácil manipulación experimental y genética. Se desarrolló un sistema de ensamblaje de ADN eficiente, recursivo y combinatorial, así como una librería de recursos genéticos modulares para la elaboración de unidades transcripcionales, regulación optogenética e integración al genoma. Mediante estos recursos fue posible elaborar redes genéticas sintéticas (SGN) que capturan las propiedades del modelo de Ising. Estos diseños comprenden estados celulares de expresión genética biestable, que son determinados por efecto de un acoplamiento local basado en quorum sensing y la influencia de una señal externa mediada por regulación optogenética. Esta representación incluye de manera explícita el “campo externo” a través de una señal lumínica, que constituye un control de fácil manipulación sobre la organización del sistema. Con el fin de registrar la dinámica de estos arreglos celulares y efectuar su control genético mediado por luz, se desarrolló un equipo modular y especializado. Este demostró ser efectivo para recopilar datos de alta calidad y rendimiento sobre el crecimiento y la expresión genética de colonias bacterianas, así como en su regulación optogenética. El equipamiento diseñado es de código abierto y bajo costo, lo que facilita su adaptación y programación para llevar a cabo diversos regímenes experimentales según los requerimientos específicos de la investigación. En su conjunto, el sistema experimental desarrollado constituye una plataforma simple, asequible y versátil para estudiar fenómenos complejos de organización celular de manera trazable. Estos recursos permitieron avanzar en el diseño de un sistema biológico cuya autoorganización puede ser dirigida mediante el control de una señal de fácil manipulación. Se espera que esta plataforma facilite el estudio del modelo de Ising como formalismo para la ingeniería de patrones espaciales complejos, fundados en acoplamiento celular local y una señal de control externa homogénea. En términos prácticos, se espera que estas herramientas contribuyan a la comprensión de los principios que subyacen la organización multicelular y abran paso a nuevos paradigmas en el diseño de tejidos, órganos, biomateriales, biopelículas y bioprocesos
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    Structural and functional characterization and engineering of Antartic enzymes as potential biocatalysts for polyethylene terephthalate (PET) degradation
    (2023) Blázquez Sánchez, Paula; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    El tereftalato de polietileno (PET) se ha convertido en uno de los principales residuos plásticos producidos a nivel mundial. En los últimos años se han descubierto microorganismos que poseen enzimas capaces de degradar el PET amorfo. La mayoría de estas enzimas son termófilas y presentan actividades óptimas de reacción entre los 60 °C y 70 °C, cerca de la temperatura de transición vítrea del PET. Posteriormente se descubrió una hidrolasa de poliéster en la bacteria mesófila Ideonella sakaiensis capaz de hidrolizar parcialmente el PET a 40 °C. En este trabajo, demostramos que hidrolasas de poliéster de las bacterias antárticas Moraxella sp. cepa TA144 (Mors1) y Oleispira antarctica cepa RB-8 (OaCut), descubiertas por técnicas bioinformáticas, hidrolizan el poliéster alifático policaprolactona y el poliéster aromático PET a una temperatura de 25 °C. Mors1 produce una reducción de peso de láminas de PET en el rango de las hidrolasas descritas previamente, constituyéndose así como la primera hidrolasa de PET psicrófila. El modelo estructural de Mors1 muestra que la composición de aminoácidos en el centro activo es similar al de sus homólogas termófilas y mesófilas. Además, el análisis metagenómico de muestras antárticas demostró que miembros de la familia Moraxellaceae portan genes que codifican otras potenciales hidrolasas de PET psicrófilas. Para mejorar la actividad de Mors1, se sustituyó un bucle altamente flexible del centro activo por el bucle equivalente de la enzima termófila LCC, lo que dio como resultado un aumento de 20 °C en la temperatura óptima de la actividad, así como un aumento de la actividad hidrolítica de PET de 4.8 veces. Simulaciones e dinámica molecular mostraron una ligera reducción en la flexibilidad en el centro activo de la enzima mutante, lo que sugiere que la actividad a temperaturas más altas se debe a una estabilización local del sitio activo. Estos resultados describen las primeras enzimas degradadoras de PET caracterizadas en organismos adaptados al frío y dan ideas sobre la relación entre la flexibilidad estructural, temperatura y actividad hidrolítica de PET de estas enzimas.