Browsing by Author "Geoffroy Jarpa, Consuelo Ignacia"

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    Análisis in vitro de los diferentes modos de unión a ADN de los factores de transcripción MarA y Rob
    (2021) Geoffroy Jarpa, Consuelo Ignacia; Melo Ledermann, Francisco Javier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    El proceso de reconocimiento molecular entre proteínas y ADN es fundamental para la vida. MarA y Rob son 2 factores de transcripción de Escherichia coli pertenecientes a la familia AraC/XylS, cuyos miembros presentan una alta similitud de secuencia y se encuentran relacionados a la regulación de genes involucrados en resistencia a antibióticos, tolerancia estrés oxidativo y resistencia a disolventes orgánicos y metales pesados [1]. La estructura de ambas proteínas incluye un dominio de reconocimiento a ADN organizado en un motivo HTH bipartito, con dos hélices clave en el reconocimiento de secuencias (Hélices 3 y 6). Adicionalmente Rob presenta un dominio regulatorio en el extremo C-terminal, cuya función aún no es bien conocida. Estudios cristalográficos previos, sugieren que ambos factores de transcripción reconocen y se unen a sus secuencias promotoras de forma distinta. Mientras que MarA interactúa con dos secuencias nucleotídicas clave denominadas cajas A y B de la región promotora y une ambas hélices al surco mayor del ADN deformándolo, Rob reconoce ambas cajas, pero tan solo se une a una de ellas sin alterar la estructura nucleica. En este estudio se abordan diferentes interrogantes y se combinan e integran datos experimentales, estadísticos y computacionales lo que permite comprender los mecanismos de reconocimiento y las diferencias planteadas. El factor de transcripción purificado se agregó in vitro a los distintos promotores degenerados y las secuencias unidas y no unidas se separaron. La estrategia general fue crear una biblioteca de sitios de unión potenciales, a partir de las secuencias unidas. Ambos extremos de las secuencias de la biblioteca tienen sitios de unión de partidores de modo que pudieron amplificarse mediante PCR y ser secuenciados mediante secuenciación masiva. Por otro lado los promotores degenerados abarcaron tanto el promotor mar como el promotor micF completo y se fueron cubriendo regiones de 4 nucleótidos. Esto permitió tener una mirada global de los factores que juegan un rol importante en el reconocimiento específico proteína-ADN. Los resultados claves de este estudio son: en primer lugar que la presencia o ausencia del dominio regulatorio, jugaría un rol en la especificidad del reconocimiento proteína-ADN. En segundo lugar, la región espaciadora no aportaría especificidad a la unión, pero sí jugaría un papel clave en cuanto a la estabilidad de la unión. Y finalmente se concluye que Rob presenta dos modos de unión alternativos en donde presenta contacto directo con el surco mayor del ADN a través de la hélice 3 y la hélice 6 o bien interactúa principalmente sólo con caja A a través de hélice 3.