Characterization of bacterial heme oxygenase ChuS of probiotic strain E. coli Nissle 1917 and its potential therapeutic uses.
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2020
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Abstract
La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo.
Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO)
y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como
antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas
están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta
inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la
modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con
células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han
identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS
que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón
que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción
de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del
sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular
directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la
microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera,
incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917
(EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al
tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está
presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si
las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para
esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del
proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de
DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte
evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC
y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del
proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a
ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta
tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se
practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población
de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A
continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis
(SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de
la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones.
De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos
linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa
probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados
con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células
T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la
cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa
(1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias
ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así
que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces
suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los
ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa
mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos
tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los
ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la
cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En
conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la
habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo
cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70.
Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico,
porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo.
Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO)
y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como
antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas
están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta
inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la
modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con
células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han
identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS
que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón
que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción
de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del
sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular
directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la
microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera,
incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917
(EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al
tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está
presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si
las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para
esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del
proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de
DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte
evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC
y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del
proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a
ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta
tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se
practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población
de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A
continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis
(SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de
la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones.
De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos
linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa
probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados
con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células
T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la
cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa
(1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias
ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así
que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces
suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los
ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa
mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos
tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los
ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la
cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En
conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la
habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo
cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70.
Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico,
porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo.
Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO)
y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como
antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas
están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta
inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la
modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con
células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han
identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS
que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón
que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción
de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del
sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular
directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la
microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera,
incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917
(EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al
tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está
presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si
las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para
esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del
proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de
DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte
evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC
y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del
proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a
ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta
tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se
practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población
de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A
continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis
(SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de
la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones.
De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos
linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa
probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados
con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células
T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la
cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa
(1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias
ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así
que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces
suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los
ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa
mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos
tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los
ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la
cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En
conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la
habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo
cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70.
Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico,
porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo.
Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO)
y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como
antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas
están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta
inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la
modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con
células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han
identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS
que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón
que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción
de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del
sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular
directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la
microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera,
incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917
(EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al
tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está
presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si
las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para
esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del
proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de
DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte
evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC
y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del
proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a
ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta
tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se
practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población
de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A
continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis
(SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de
la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones.
De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos
linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa
probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados
con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células
T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la
cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa
(1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias
ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así
que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces
suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los
ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa
mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos
tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los
ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la
cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En
conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la
habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo
cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70.
Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico,
porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.
Description
Tesis (Doctor in Biological Sciences, mention Molecular Genetics and Microbiology)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2020