Unravelling the role of Argonaute1 phosphorylation in the nitrate response of Arabidopsis thaliana.
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Date
2020
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Abstract
ARGONAUTA 1 (AGO1) es parte esencial del complejo de silenciamiento RISC (inglés de RNA-induced silencing complex), jugando un rol protagonista como endonucleasa cuya actividad controla la expresión génica tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El presente trabajo surge a partir de la observación en que nitrato altera el patrón de fosforilación de AGO1 en raíces de plantas de Arabidopsis thaliana. Nitrato, además de su rol como nutriente, es una molécula que actúa como una potente señal, gatillando una cascada de señalización que controla la expresión de cientos de genes. Si bien, la fosforilación detectada ha sido observada en otros fosfo-proteomas tanto en Arabidopsis como otras especies, a la fecha, no contamos con antecedentes que profundicen sobre el rol que cumpliría esta modificación en la función o actividad de AGO1 en plantas. Por otro lado, a nuestro haber existe incontable evidencia que demuestra el rol de AGO1 como una proteína esencial para la respuesta a estrés tanto biótico como abiótico, en la fertilidad y el completo desarrollo de las plantas. A partir de estos antecedentes, nos preguntamos: ¿Cuál es el rol de esta fosforilación sobre la función de esta crucial proteína? Con el fin de hacer frente a esta pregunta, evaluamos procesos del desarrollo y la respuesta molecular de plantas cuyo sitio de fosforilación ha sido mutado. Para ello, generamos plantas cuya proteína AGO1 posee una alanina (A, fosfo-nula) o un ácido aspártico (D, fosfo-mímica) en reemplazo de la serina fosforilable. Evaluamos el impacto de modificar el patrón de fosforilación de AGO1 sobre el crecimiento, incluyendo como variable en el medio diversas concentraciones de nitrato. Nuestros resultados apuntan a que la fosforilación de AGO1 es necesaria para que las plantas completen un ciclo de vida óptimo. Hemos observado que impedir la fosforilación de AGO1 (fosfo-nula) afecta negativamente el desarrollo y fertilidad de las plantas, produciendo fenotipos que abarcan desde un menor tamaño de plántulas, hasta una reducción en el número de semillas. Al analizar los posibles mecanismos causantes de estos fenotipos, determinamos que ni la acumulación ni la carga de los miRNAs sobre AGO1 fueron afectadas. Sin embargo, la abundancia de transcritos de cientos de genes se vio alterada cuando ambas variables fueron evaluadas: la mutación del sitio de fosforilación y la concentración de nitrato en el medio. Tomando en cuenta que la función de AGO1 abarca prácticamente todos los niveles de la regulación génica, pero que la actividad endonucleasa determina el silenciamiento post-transcripcional y, por tanto, la abundancia de transcritos de blancos de miRNAs, pudimos observar que, si bien la actividad slicer puede verse alterada, no se anula completamente. Esta y otras observaciones sustentan el hecho de que impedir que ocurra la fosforilación de AGO1 no significa una alteración sustancial del desarrollo sino más bien un conjunto de fenotipos que dan cuenta del efecto pleiotrópico de AGO1, tanto en condiciones normales como bajo diferente disponibilidad de nitrato. Nuestros resultados apuntan a que la fosforilación de la proteína AGO1 representa un nuevo mecanismo de regulación de la expresión génica en plantas que, en conjunto con otros, modula la abundancia de los mRNAs y como consecuencia, el desarrollo y la respuesta a nitrato en plantas. En consideración de las múltiples, esenciales y emergentes funciones que abarca la actividad de AGO1 en plantas, dilucidar cómo esta fosforilación y otras modificaciones modulan eventos tales como la localización subcelular y la interacción con otros componentes celulares, es fundamental para comprender el rol de la regulación post-traduccional en la actividad del controlador central de la expresión génica, AGO1.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas mención Genética Molecular y Microbiología)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2020