Bioprocess engineering and metabolic modeling as a roadmap for enhanced recombinant protein production in Pichia pastoris
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Date
2019
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Abstract
Pichia pastoris es reconocida como un workhorse biotecnológico para la expresión de
proteínas recombinantes. Basándose en sus logros pasados y novedosos desarrollos, la
biotecnología de sistemas de P. pastoris ha progresado significativamente en las últimas
dos décadas.
En esta tesis doctoral, el análisis sistemático de las condiciones operativas en
conjunto con el desarrollo de herramientas computacionales y la selección de
configuraciones mecánicas óptimas de bioreactores se llevaron a cabo como una hoja de
ruta para mejorar la producción de proteínas recombinantes a través de la ingeniería de
bioprocesos y el modelamiento metabólico. A pesar de que nosotros utilizamos una cepa
de P. pastoris que expresaba constitutivamente la proteína endulzante taumatina, como
caso de estudio, los desarrollos logrados también son aplicables para la expresión de otras
proteínas recombinantes de interés.
Primero, presentamos un marco integrado para revelar los efectos metabólicos de
dos parámetros operacionales – la tasa específica de crecimiento y la concentración de
oxígeno disuelto - en cultivos continuos limitados en glucosa. Más específicamente,
empleamos un diseño experimental racional para calcular los efectos estadísticos
significativos de los datos de múltiples quimiostatos, que luego fueron contextualizados
utilizando un modelo metabólico a escala del genoma manualmente curado. Nuestros
resultados revelaron un efecto negativo de la oxigenación en la tasa especifica de
producción del producto y un efecto positivo en el rendimiento de la biomasa. En
particular, identificamos un efecto sinérgico de ambos parámetros en la tasa específica de
producción del producto. Finalmente, las predicciones del modelo indicaron una relación
opuesta entre el nivel de oxigenación y el requerimiento de ATP asociado al crecimiento,
sugiriendo un mayor gasto metabólico de crecimiento a bajo nivel de oxigenación.
En segundo lugar, construimos un modelo metabólico a escala genómica dinámico
para cultivos aeróbicos de Pichia pastoris limitados en glucosa. El modelo se empleó para
analizar la distribución del flujo metabólicos de un cultivo alimentado por lotes y para
diseñar estrategias genéticas y de ingeniería de procesos para mejorar la producción de
albúmina sérica humana recombinante. Simulaciones de knock-outs individuales indicaron
que la desviación del carbono hacia la formación de cisteína y triptófano podría mejorar en
63 veces la producción de HSA. Además, el modelo sugirió que la implementación de una
tasa de crecimiento específica decreciente durante la fase de alimentación de un cultivo
alimentado por lotes produce un aumento del 25% de la productividad volumétrica de la
proteína.
Finalmente, se llevó a cabo una optimización de la tasa de transferencia de oxígeno
en reactores de 1 L. Para este propósito, primero discutimos la formulación de un
algoritmo automático para la estimación de kLa bajo diferentes condiciones
hidrodinámicas. Luego, presentamos una hoja de ruta para optimizar la tasa de
transferencia de oxígeno en bioreactor de 1-L, utilizando diferentes configuraciones de
aspas-difusor. La importancia relativa de la aireación y agitación bajo las diferentes
configuraciones y condiciones hidrodinámicas fueron llevadas a cabo. Finalmente,
propusimos un árbol de decisión para la selección de la mejor configuración con el fin de
mejorar la transferencia de oxígeno en bioreactores según el rango de los parámetros
operacionales y la viscosidad.
En general, esta tesis es un intento exitoso de analizar y comprender los efectos
metabólicos utilizando un diseño racional de experimentos y modelos metabólicos.
Además, este análisis sistemático en cooperación con una optimización de la transferencia
de oxígeno en bioreactores permitirá mejorar la producción de proteínas recombinantes en
Pichia pastoris.
Description
Tesis (Doctor in Engineering Sciences)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2019