Construction of a yeast platform for the synthesis of high value natural flavours
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Date
2016
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Abstract
La ingeniería metabólica ha abierto una oportunidad para la producción de una amplia variedad de compuestos de alto valor industrial, especialmente aquellos producidos en bajas concentraciones desde fuentes no-renovables, o cuya síntesis química es difícil y costosa. En el caso de los terpenos, existen numerosas oportunidades y estrategias para su síntesis bioquímica usando microorganismos naturales o “ingenierizados”. Saccharomyces cerevisiae es uno de los principales microorganismos usados para la expresión heteróloga de genes, debido principalmente a su rápido crecimiento en diferentes fuentes de carbono, el amplio conocimiento de su genoma y las herramientas para su manipulación, y su robustez en fermentaciones a gran escala. Además, en el caso de S. cerevisiae, la vía del mevalonato que lleva finalmente a la producción de ergosterol, es también capaz de producir precursores de compuestos de alto valor. Avances en el campo de la biología de sistemas, ingeniería evolutiva, y biología sintética han acelerado el progreso para el uso de esta levadura como la factoría celular microbiana de elección.En este trabajo se construyeron una serie de plataformas en levadura para la síntesis de dos tipos de terpenos: el monoterpeno carvona y el norisoprenoides β-ionona. Los monoterpenos son principalmente producidos por las plantas como mecanismo de defensa contra depredadores, y pueden ser usados por la industria de los alimentos como antisépticos, fragancias y aditivos. Los norisoprenoides son conocidos por su agradable aromas y también usados en la industria de alimentos como aditivos, pero además, altamente apreciados por la industria cosmética. En este estudio, se usaron diferentes promotores de expresión y plasmidios para controlar la transcripción y la dosis génica. Para la síntesis de norisoprenoides, se construyeron varias cepas de levadura, capaces de producir β-ionona. Primero, se integraron tres genes heterólogos en la cepa ingenierizada SCGI22a: los genes carotenogénicos crtYB y crtI de Xanthophyllomyces dendrorhous, para producir β-caroteno, y el gen dioxigenasa de escisión de carotenos, (gen PhCCD1), de Petunia hybrida, para producir β-ionona. En esta cepa se alcanzó una concentración final de 0,63 ± 0,02 mg/g biomasa en matraces. Una posterior expresión de estos tres genes en vectores de alta copia, mejoró la concentración final, alcanzando mas de 5 mg/L en cultivos batch (Capítulo 2).La acumulación de ß-caroteno en todas las cepas construidas, puede indicar una baja eficiencia en la actividad de la enzima CCD1, o una baja expresión de su gen. Debido a que en este estudio, la sobre-expresión de este gen resultó en cepas que crecían muy lento, se decidió cambiar el promotor original usado para este gen (PTEF1) por el promotor Gal1 inducible por luz. En este sistema, el factor de transcripción Gal1 fue dividido en sus dominios de unión a ADN (BD) y de activación (AC), y estos dos componentes fusionados a dos criptocromos de Neurospora crassa llamados White collar -1 (WC-1) y Vivid-1 (VVD1). Estas dos flavoproteínas responden a luz azul interaccionando una con otra, reconstituyendo el factor de transcripción Gal1. A pesar de que este sistema funcionó con un gen reportero, no se logró optimizar la producción de β-ionona, probablemente por la inducción prolongada con luz, lo que afectaría a los carotenos (Capítulo 3). Sin embargo, este sistema presenta varias ventajas y futuras optimizaciones son promisorias.Finalmente, utilizando el mismo diseño usado para la producción de norisoprenoides, se construyó una cepa de levadura para la producción de los monoterpenos limoneno y carvona (Chapter 4). Para ello, se expresaron cinco genes heterólogos: El gen GPPS de Abies grandis que codifica para la enzima geranil difosfato sintasa; los genes de Mentha piperita, LS, LH y CD para la producción de los monoterpenos limoneno, trans-carveol y carvona respectivamente; y una versión mutada del gen de levadura ERG20, que codifica para la enzima que produce geranil difosfato (GPP) y farnesil difosfato (FPP). Ningún monoterpeno fue detectado en cultivos de esta cepa, debido posiblemente a la volatilidad/toxicidad de los monoterpenos y la ausencia de su precursor directo GPP. Otras optimizaciones son necesarias. Aún hay mucho espacio para la optimización de las cepas creadas en este estudio. El conocimiento generado, junto con los extraordinarios avances en biología sintética, nos permitirán la posibilidad de producir compuestos industrialmente competitivos, a través de procesos sustentables y de bajo costo.
Description
Tesis (Doctor in Engineering Sciences)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2016