Abstract:
La apoptosis en células germinales es fundamental en la regulación de la producción diaria de
espermatozoides, y se lleva a cabo tanto en condiciones fisiológicas como inducidas por
agentes externos como lo son los genotóxicos, que dañan al DNA, y xenoestrógenos, que
imitan a los estrógenos endógenos. Se sabe que los xenoestrógenos como Bisfenol A (BFA) y
4-Nonilfenol (NF) inducen un incremento del índice apoptótico en células de testículos de
ratas y ratones y una baja producción de espermatozoides en estos animales. Sin embargo, el
mecanismo que subyace a este efecto es desconocido.
La ADAM17 (A Desintegrin And Metalloprotease-17) es una metaloproteasa de
transmembrana relevante en la señalización paracrina/yuxtacrina y autocrina. En nuestro
laboratorio se ha mostrado que la inhibición farmacológica de la ADAM17 disminuye la
apoptosis de células germinales masculinas tanto en condiciones fisiológicas como en la
inducida por drogas anticancerígenas y xenoestrógenos. Sin embargo, aún se desconoce si la
presencia de la ADAM17 en las células germinales es fundamental en la apoptosis de estas
células. Es por ello, se propuso la siguiente hipótesis: La presencia de ADAM17 es necesaria
para la apoptosis de células germinales masculinas tanto fisiológica como inducida por los
xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del ratón. En donde se plantearon 4
objetivos específicos: (1) Determinar la participación de la ADAM17 de las células germinales
masculinas meióticas y post-meióticas sobre la apoptosis de estas células in vivo, (2) Evaluar
la participación de la ADAM17 de las células germinales masculinas meióticas y postmeióticas sobre la apoptosis de estas células inducida por los xenoestrógenos BFA y NF in
vivo, (3) Determinar el efecto de los xenoestrógenos BFA y NF sobre la actividad de la
ADAM17 y (4) Estudiar in vitro la participación de la ADAM17 sobre la apoptosis inducida
por BFA y NF en líneas celulares.
Para esto, se creó un ratón knock out condicional para la ADAM17 en células
germinales masculinas utilizando la tecnología Cre-LoxP. En estos ratones se observó que la
apoptosis fisiológica e inducida por los xenoestrógenos BFA y NF disminuyó
significativamente en relación a los silvestres cuando se evaluó el número de células caspasa-3
activa mediante inmunofluorescencia, el número de células picnóticas por tinción Pas-He, y el
porcentaje de células TUNEL positivas. Usando estos ratones se estableció que la presencia de
la ADAM17 es fundamental en la apoptosis de células germinales masculinas tanto en
condiciones fisiológicas como inducida por BFA y NF. Además, se determinó la participación
de esta metaloproteasa en el desarrollo de la espermatogénesis. Para ello, se calculó el
porcentaje del peso testicular en comparación al peso corporal a los 21 y 60 días de edad,
donde se observó una disminución significativa de este en ratones knock out respecto a los
wild type. Esto puede ser explicado por la disminución en los parámetros histológicos del
testículo, como la altura del epitelio, diámetro de los túbulos seminíferos y del lumen de los
túbulos seminíferos observado en los ratones knock out respecto a los wild type.
Por otro lado, para dilucidar si BFA y NF inducen actividad metaloproteasa de la
ADAM17 (lo cual sería fundamental para la muerte de las células germinales) se creó un
sistema in vitro en el cual se expresó una proteína que tiene el dominio intracelular, el de
transmembrana y parte del dominio extracelular de 5 sustratos de la ADAM17 fueron
fusionados con fosfatasa alcalina (FA). Estos sustratos son Neuregulina β1 (NRGβ1), Tumor
Necrosis Factor α (TNFα), Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), Kit Ligand 2
(KitL2), o Transforming Growth Factor α (TGFα). Este sistema in vitro fue expresado en
líneas celulares de células de Sertoli de ratón (TM4), en células de cáncer de próstata humana
(LnCaP), o en células de fibroblasto de embrión de ratón (mEFs). De esta manera, se midió la
liberación de fosfatasa alcalina al medio de cultivo (mediante la actividad de FA), lo que
indirectamente refleja la actividad metaloproteasa de la ADAM17. Usando este sistema in
vitro, se mostróque la inhibición farmacológica y/o genética (knockdown) de la ADAM17
previene la liberación de FA inducida por BFA o NF. Además, utilizando células mEFs que
pierden iRhom1 y/o iRhom2 (proteínas inactivadas de la familia romboide) se determinó que
la activación de ADAM17 inducida por BFA y NF depende de iRhom2 pero no de iRhom1.
Por último, mediante los niveles proteicos del fragmento de 86 kDa de PARP (sustrato de
caspasa-3) evaluados por western blot; el porcentaje de la población de células sub-G1 y de
células Anexina V evaluadas por citometría de flujo se determinó que la inhibición genética de
la ADAM17 previene la muerte celular inducida por BFA y NF.
En conclusión la ADAM17 participa en la apoptosis de células germinales tanto
fisiológica como inducida por los xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del
ratón.
