Lipopolisacárido afecta el transporte mucociliar alterando el mecanismo de liberación de ATP que regula la actividad ciliar en las vías respiratorias de ratón
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Date
2014
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Abstract
En el epitelio mucociliado, la eficiencia del transporte mucociliar (TMC) es determinada por la frecuencia de batido ciliar (FBC) y la actividad coordinada del movimiento de los cilios. Señales químicas producidas localmente por el epitelio como el adenosin trifosfato (ATP), pueden modificar la actividad ciliar del epitelio respiratorio, por su interacción con los receptores purinergicos P2Y. Lipopolisacarido (LPS) un componente de la pared bacteriana, un conocido agente inflamatorio, cuyos efectos están mediados por el receptor TLR4, sin embargo hay poca evidencia sobre los efectos de LPS sobre la actividad ciliar y los mecanismos de liberación de ATP en epitelio respiratorio. Para estudiar el efecto de LPS en la actividad ciliar y las vías de señalización involucradas, utilizamos cultivos primarios de epitelio ciliado de tráquea de ratón. La FBC fue determinada mediante videomicroscopia y el ATP extracelular fue medido mediante el ensayo de luceferin luciferasa, en condiciones control y en presencia de fármacos antagonistas e inhibidores de las distintas vías de señalización. También determinamos la velocidad de transporte mucociliar por el movimiento de las microesferas sobre el epitelio de la tráquea.En este estudio, determinamos que LPS incrementa la FBC y la velocidad de transporte de las microesferas. El incremento en la FBC está asociado a un incremento en ATP extracelular. El incremento de la FBC fue bloqueado mediante el uso de apirasa, enzima que hidroliza el ATP extracelular. La participación de la vía de señalización TLR fue evaluado en el efecto de LPS sobre la FBC. Mediante PCR e inmunofluorescencia detectamos la expresion del receptor TLR4 en los cultivos primarios. Antagonistas de NF-κB no lograron bloquear el incremento de la FBC inducido por LPS, sugiriendo que la activación de este factor de transcripción no participa en el incremento de la FBC.Usando antagonistas de receptores purinergicos P2X7 (P2X7R) y Panexina 1 (Panx1), determinamos que ambos participan en el mecanismo de liberación de ATP inducido por LPS. Adicionalmente, establecimos mediante el ensayo de captación de colorante, que LPS induce apertura de Panx1. Un quelante de Ca2+, BAPTA-AM bloquea el incremento en la FBC y la liberación de ATP inducido por LPS. Antagonistas específicos de la vía de señalización P2Y, bloquean el incremento en la FBC inducido por LPS. Estos resultados sugieren que LPS induce liberación de ATP al extracelular por un mecanismo que involucra la participación de Panx1 y P2X7R y luego este ATP activa la vía de señalización mediada por la vía de señalización P2Y. En conclusión, nuestros resultados demuestran que LPS es una señal química que participa en la regulación de la actividad del batido ciliar, aumentando la FBC y la velocidad del transporte mucociliar en células ciliadas de tráquea de ratón. Estos resultados dan evidencias del mecanismo por el cual factores ambientales pueden inducir una respuesta fisiológica funcional que afecta el clearance mucociliar.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas, mención Ciencias Fisiológicas)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2014