Estudio de la biogénesis y expresión de mirrorRNAs en el transcriptoma de mamíferos.
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Date
2014
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Abstract
Con el advenimiento de nuevas tecnologías se ha descubierto la gran complejidad del transcriptoma de los mamíferos. Se ha reportado la existencia de un tipo especial de transcritos antisentido naturales (NATs), que son perfectamente complementarios a mRNAs sentido a lo largo de varios exones, incluyendo los sitios de unión entre exones. En esta tesis estos transcritos antisentido naturales son llamados mirrorRNAs. Hasta el momento aun existe controversia si los mirrorRNAs son RNAs no codificantes reales o artefactos experimentales. No se han hecho análisis sistemáticos que permitan conocer la abundancia y diversidad de los mirrorRNAs en el transcriptoma humano y tampoco se ha estudiado el mecanismo mediante el cual los mirrorRNAs son generados. En la literatura se han propuesto dos hipótesis para explicar su biogénesis. La primera hipótesis es que estos transcritos son generados por la transcripción bidireccional de un locus y que posteriormente los transcritos antisentido sufren splicing en los sitios no consenso CT-AC, que son los sitios complementarios a los sitios consenso GT-AG. La segunda hipótesis que se ha planteado es que los mirrorRNAs se producen por una actividad RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) que utiliza como molde un mRNA maduro, generando un transcrito antisentido perfectamente complementario. En esta tesis planteamos una tercera hipótesis: Los mirrorRNAs provienen de la transcripción antisentido de pseudogenes procesados presentes en el genoma.
En la presente tesis se realizó un análisis sistemático de la existencia de mirrorRNAs en el transcriptoma humano, utilizando datos de ESTs, cDNAs y de RNA-Seq hebra específica. Además, se validaron experimentalmente mirrorRNAs predichos utilizando 3\2019 RACE, 5\2019 RACE y RPA-RT-PCR. Mediante estas aproximaciones se determinó que existen cientos de genes con evidencia bioinformática de que poseen mirrorRNAs. Adicionalmente, se determinó que los mirrorRNAs presentan bajos niveles de expresión y que parte de ellos no estarían poliadenilados. Dentro de la lista de genes predichos para poseer un mirrorRNA se identificó un enriquecimiento de genes que participan en traducción de proteínas y de genes que poseen pseudogenes procesados. Luego se analizó si los mirrorRNAs podrían generar endo-siRNAs con sus contrapartes sentido. Utilizando datos de RNA-Seq generados por ENCODE, no se identificaron endo-siRNAs derivados de mirrorRNAs. En la búsqueda de mirrorRNAs se identificaron múltiples NATs provenientes de la transcripción antisentido de pseudogenes procesados. En relación a la biogénesis de los mirrorRNAs se estudió si la maquinaria de splicing celular puede procesar intrones en los sitios complementarios a los consenso. Utilizando datos de ESTs y cDNAs de ratón y humano se realizó una búsqueda sistemática de posibles intrones CT-AC. Posteriormente se realizaron validaciones experimentales de múltiples intrones candidatos.
No se encontró ningún intrón que se procesara en sitios con secuencias complementarias a las consenso. Se encontró que múltiples artefactos experimentales y de alineamiento pueden llevar a la falsa identificación de intrones no canónicos. Adicionalmente se llevaron a cabo experimentos de splicing in vivo utilizando minigenes de transcritos que podrían sufrir splicing en sitios CT-AC. Nuestros análisis muestran que la maquinaria de splicing celular no es capaz de reconocer las secuencias complementarias a las consenso. Se buscó la existencia de actividad RdRP en células humanas usando datos de RNA-Seq, sin resultados positivos. A pesar de lo anterior, no es posible descartar del todo que la actividad RdRP exista y sea la responsable de la existencia de algún mirrorRNA. En diversos trabajos recientes se ha descrito la existencia de pseudogenes procesados polimórficos en la población humana. Múltiples mirrorRNAs pueden ser explicados por la transcripción antisentido de estos pseudogenes procesados polimórficos. Adicionalmente se abre la posibilidad que los mirrorRNAs sean la evidencia transcripcional de eventos de retrotransposición que no estén anotados en el genoma de referencia. En conclusión los resultados de esta tesis demuestran la existencia de mirrorRNAs en células humanas. Además nuestros resultados respaldan que la maquinaria de splicing celular no es capaz de procesar intrones en los sitios complementarios a los consenso. Finalmente nuestros datos sugieren que los mirrorRNAs son generados desde pseudogenes procesados polimórficos.
En la presente tesis se realizó un análisis sistemático de la existencia de mirrorRNAs en el transcriptoma humano, utilizando datos de ESTs, cDNAs y de RNA-Seq hebra específica. Además, se validaron experimentalmente mirrorRNAs predichos utilizando 3\2019 RACE, 5\2019 RACE y RPA-RT-PCR. Mediante estas aproximaciones se determinó que existen cientos de genes con evidencia bioinformática de que poseen mirrorRNAs. Adicionalmente, se determinó que los mirrorRNAs presentan bajos niveles de expresión y que parte de ellos no estarían poliadenilados. Dentro de la lista de genes predichos para poseer un mirrorRNA se identificó un enriquecimiento de genes que participan en traducción de proteínas y de genes que poseen pseudogenes procesados. Luego se analizó si los mirrorRNAs podrían generar endo-siRNAs con sus contrapartes sentido. Utilizando datos de RNA-Seq generados por ENCODE, no se identificaron endo-siRNAs derivados de mirrorRNAs. En la búsqueda de mirrorRNAs se identificaron múltiples NATs provenientes de la transcripción antisentido de pseudogenes procesados. En relación a la biogénesis de los mirrorRNAs se estudió si la maquinaria de splicing celular puede procesar intrones en los sitios complementarios a los consenso. Utilizando datos de ESTs y cDNAs de ratón y humano se realizó una búsqueda sistemática de posibles intrones CT-AC. Posteriormente se realizaron validaciones experimentales de múltiples intrones candidatos.
No se encontró ningún intrón que se procesara en sitios con secuencias complementarias a las consenso. Se encontró que múltiples artefactos experimentales y de alineamiento pueden llevar a la falsa identificación de intrones no canónicos. Adicionalmente se llevaron a cabo experimentos de splicing in vivo utilizando minigenes de transcritos que podrían sufrir splicing en sitios CT-AC. Nuestros análisis muestran que la maquinaria de splicing celular no es capaz de reconocer las secuencias complementarias a las consenso. Se buscó la existencia de actividad RdRP en células humanas usando datos de RNA-Seq, sin resultados positivos. A pesar de lo anterior, no es posible descartar del todo que la actividad RdRP exista y sea la responsable de la existencia de algún mirrorRNA. En diversos trabajos recientes se ha descrito la existencia de pseudogenes procesados polimórficos en la población humana. Múltiples mirrorRNAs pueden ser explicados por la transcripción antisentido de estos pseudogenes procesados polimórficos. Adicionalmente se abre la posibilidad que los mirrorRNAs sean la evidencia transcripcional de eventos de retrotransposición que no estén anotados en el genoma de referencia. En conclusión los resultados de esta tesis demuestran la existencia de mirrorRNAs en células humanas. Además nuestros resultados respaldan que la maquinaria de splicing celular no es capaz de procesar intrones en los sitios complementarios a los consenso. Finalmente nuestros datos sugieren que los mirrorRNAs son generados desde pseudogenes procesados polimórficos.
Description
Tesis (Doctor en Ciencias Biológicas, mención en Biología Celular y Molecular)--Pontificia Universidad Católica de Chile, 2014