3.06 Tesis doctorado

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Associations between habitat conditions, sociality, and brain organization in octodontid rodents.
(2014) Sobrero Inverardi, Raúl Eduardo; Ebensperger Pesce, Luis Alberto; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Nuestro conocimiento sobre la evolución del comportamiento social en roedores octodóntidos es aún fragmentario. La información disponible indica que las especies filogenéticamente basales son solitarias, mientras que las más derivadas tienden a ser sociales. Sin embargo, la información sobre la estructura social disponible para varias especies es anecdótica, lo cual dificulta el establecimiento de conclusiones robustas sobre la evolución del comportamiento social en este clado. Este es el primer estudio que cuantifica la actividad, uso del espacio, y comportamiento social del degú costino (Octodon lunatus), una especie derivada de octodóntido. Durante noviembre y diciembre de 2010 y 2011 se utilizaron métodos de captura-recaptura y telemetría para cuantificar el patrón diario de actividad superficial, ámbitos de hogar, solapamientos entre ámbitos de hogar, y uso compartido de parches de descanso y nidificación en una población costera localizada en el centro-norte de Chile.La actividad de O. lunatus, medida como desplazamientos individuales entre localizaciones consecutivas, mostró una tendencia estadísticamente no significativa a ser mayor en horas de la noche. Durante el día los animales usaron 1 a 3 sitios de descanso y anidamiento asociados con una alta cobertura arbustiva, donde Pouteria splendens (lúcumo) fue la especie dominante. Machos y hembras compartieron estos sitios de descanso en múltiples ocasiones. El solapamiento entre los ámbitos de hogar tendió a ser mayor en animales que además compartieron sitios de descanso comparado con animales que no compartieron estos sitios. En base al uso compartido de refugios se identificó 1 grupo social en 2010 y 4 grupos en 2011. La composición de estos grupos fue de 1 a 3 hembras adultas y de 1 a 2 machos adultos (2 a 4 adultos en total). Globalmente, los resultados indicaron que O. lunatus muestra algún grado de sociabilidad, observación que apoya una tendencia en la cual el comportamiento social es más frecuente en especies filogenéticamente derivadas de octodóntidos.
Biogeografía histórica reciente de los vertebrados del "Hotspot" de Chile mediterráneo: dinámicas de distribución y nicho climático de linajes intraespecíficos, desde el último máximo glacial hasta el presente
(2015) Gutiérrez Tapia, Pablo Andrés; Palma Vásquez, Ramón Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Biodiversity losses under the species level (i.e. cryptic diversity) may have been severely undersestimated in future global climate change scenarios. Therefore, it’s important to characterize diversity units at this level, and also understand its ecological responses to climatic forcings. We have chosen an endemic rodent from a highly endangered area as a model to look for cryptic distributional responses below the species level: Phyllotis darwini in the central Chile biodiversity hotspot. This area harbors a high amount of endemic species, and it’s known to have experienced vegetational displacements between two mountain systems during and after the Last Glacial Maximum. We’ve implemented an approach which integrates phylogeographic information into species distribution models. Our major findings are that the species is compossed of two major phylogroups: one of them has a broad distribution mainly accros valley but also in mountain ranges, meanwhile the other displays a disjunct distribution across both mountain ranges and always above a 1500 m altitude limit. Lineage distribution model under LGM climatic conditions sugget that both lineages were codistributed in the southern portion of P. darwini’s current geographic range, and mainly at the valley and coast. We’ve concluded that present distribution of lineages in P. darwini is the consequence of this cryptic distributional response to climate change after LGM, with a postglacial colonization with strict altitudinal segregation of both phylogroups.
BZIP transcription factors and transcriptional regulatory networks in the neurospora circadian system
(2014) Montenegro Montero, Alejandro Esteban; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Circadian clocks are endogenous cellular timekeepers that confer daily rhythms to a large number of biological processes. These clocks are present in various organisms across different evolutionary lineages, in which they regulate close to 24-hours rhythms in gene expression, physiology and behavior, enabling individuals to anticipate predictable environmental variations. The ascomycete Neurospora crassa has played a key role in the unveiling of the molecular and genetic basis of these time-telling machineries. In Neurospora, as in other eukaryotes, the integration of a series of cellular and molecular processes gives rise to a robust cell-based pacemaker, capable of coordinating rhythmic control of several aspects of their biology. Although a detailed molecular description of the core oscillator or pacemaker is now possible in model eukaryotes, there is limited information on the mechanisms that allow it to regulate rhythmic processes. Such “output pathways”, the circuits through which the pacemaker endows different processes with rhythmicity, are the least characterized aspect of circadian systems. In Neurospora, a hierarchical arrangement of transcriptional regulators has been proposed as the main mechanism through which the clock regulates rhythmic gene expression.The different actors involved in such time relay, connecting the oscillator with overt rhythms, are however largely unknown. In addition, despite decades as a research model organism, little is known about transcriptional regulatory networks in this fungus and the vast majority of transcription factors in Neurospora remain uncharacterized. In an effort to improve current knowledge of output pathways, the most neglected aspect of circadian biology, in a clock model system and study transcriptional regulatory networks in a model eukaryote, we set out to characterize the bZIP family of transcriptional regulators in Neurospora, in the context of its circadian system. We report a complete revision of the list of sequence-specific DNA-binding proteins in this fungus, which resulted in the identification of several novel ones, including many bZIP proteins. As the few transcription factors that have been associated with output pathways in Neurospora have been shown to exhibit clock input, we evaluated whether the expression of bZIP encoding genes in this organism is under control of the circadian clock. By using a luciferase-based, high-throughput screening system, we identified several bZIP encoding genes whose expression is regulated by the circadian pacemaker. A major limitation in the study of transcriptional regulatory networks in Neurospora, such as those underlying clock regulated transcription, stems from the fact that little is known about the sequence preference of its transcription factors. With the goal of identifying and characterizing transcriptional regulatory networks in which the putative Neurospora transcription factors participate, we employed double-stranded DNA microarrays known as protein-binding microarrays, to determine the sequence preference of Neurospora transcription factors.Such an approach allows for rapid, high-throughput and unbiased characterization of the sequence specificity of DNA-binding proteins. This resulted in the determination of the sequence preference of over half of Neurospora predicted transcription factors, information that together with the various molecular tools available in Neurospora, led to the identification of a rhythmically expressed bZIP transcription factor, ADA-1, as a regulator of output pathways in Neurospora, controlling various output genes. In addition, this information allowed for the evaluation of the role of another bZIP transcription factor, ASL-1, in such pathways. Notably, this is the first report aimed at studying DNA-binding specificities on a global scale in the fungal kingdom outside of the yeast clade, representing a powerful resource for the study of transcriptional regulatory networks in filamentous fungi, the largest group within the fungal kingdom. Indeed, through the use of these data we identified, for the first time, a transcription factor that is required for growth under osmotic stress in Neurospora. Lastly, we report on the identification of a novel process involved in output pathways in Neurospora, namely cell fusion pathways, and we herein show it to be necessary for proper rhythms in a number of genes, including bZIP encoding genes. As a whole, the work reported in this Thesis, represents a major advancement in the study of bZIP proteins and transcriptional regulatory networks in Neurospora.
Caracterización de la regulación transcripcional y función del gen SDH2-3 de Arabidopsis thaliana.
(2013) Restovic Carvajal, Franko; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Our group has undertaken the study of mitochondrial function in plants focusing on complex II (succinate dehydrogenase, SDH) of Arabidopsis thaliana. This complex plays a pivotal role in the tricarboxylic acid (TCA) cycle and the electron transport chain, two fundamental processes in the energetic plant metabolism. We have described the existence of three nuclear genes coding for iron-sulfur proteins (SDH2), named SDH2-1, SDH2-2 and SDH2-3. Two of them, SDH2-1 and SDH2-2, are almost identical (96%) and share the same exon-intron structure. SDH2-3 on the other hand, has a different exonintron structure and has approximately 70% identity to the other two. Additionally, unlike SDH2-1 and SDH2-2 that are expressed in adult plants, SDH2-3 expression is confined to seed maturation and it decreases during germination, while SDH2-1 and SDH2-2 transcripts are low in seeds and they begin to accumulate after germination and during vegetative growth. We have described seed-specific cis-elements necessary for promoter activity (three ABA-responsive elements or ABRE and one RY element) and determined in vitro binding of seed-specific transcription factors to them (bZIP10, bZIP25 and bZIP53 binding to ABREs; ABI3 and FUS3 binding to RY). Moreover, we have determined that ABI3 and FUS3 are necessary for promoter activity in planta, as mutant lines of these factors showed decreased SDH2-3 levels in seeds. On the other hand, we have determined that SDH2-3 is important for seed germination, indicating a specific role during this developmental stage. The main focus of this thesis work is to study the seed-specific expression and the function of SDH2-3. It is worth noting that no reports of mitochondrial proteins bearing this singular expression pattern have been published. Therefore, we will determine essential regions of the SDH2-3 promoter and additional putative cis-elements controlling transcriptional regulation, transcription factors involved, and the function of this protein during seed maturation and postgerminative growth. Regarding the SDH2-3 promoter, during this thesis we were able to determine a minimal region necessary and sufficient for promoter activity, between -114 and +49 from the transcription start site. Moreover, the 5´UTR region (+1 to +49) is essential for SDH2-3 promoter activity, as determined by loss-of-function experiments. In addition, transient expression assays showed that ABI3 is able to activate SDH2- 3 transcription in vivo alone or in combination with bZIP factors bZIP10, bZIP25 or bZIP53. However, single bZIP factors were unable to activate the promoter, and only transfection with bZIP10 and bZIP53 was able to induce expression. Moreover, SDH2-3 transcript levels are significantly reduced in bzip53 mutant dry seeds. These results indicate the SDH2-3 promoter is activated by bZIP transcription factors and corroborate the importance of ABI3. On the other hand, we determined that SDH2-3 influences seed development and maturation, as lack of this protein resulted in decreased seed weight. Interestingly, protein content also showed a reduction in sdh2-3 mutants while lipid content did not show any biologically significant variation. This is an interesting feature since seed metabolism is directed during maturation towards the formation of seed proteins and lipids. Thus, the decrease in protein content would explain the lower total weight. Although it has been suggested that mitochondria plays a minor role during seed maturation, these results suggest that its role should be reconsidered, as it may carry out important metabolic tasks during this stage. Mitochondrial role during postgerminative growth is well characterized. Here we show that sdh2-3 mutants have impaired hypocotyl growth in the dark. Moreover, TTFA treatment (complex II inhibitor) abolishes hypocotyl growth and seedling establishment. All these results suggest an essential role for complex II during postgerminative growth and establishment. Wild seeds in nature generally germinate underground, in conditions where they lack direct sunlight. A seed with a non-functional SDH2-3 would be in disadvantage over wild-type seeds, which would elongate their hypocotyls further until they reach light in order to promote photoautotrophic growth. SDH2-3 gives an important advantage to the plant in energy-consuming processes such as germination and early stages towards seedling establishment. This work shows the importance that this nonessential gene can have in critical stages of plant development. The existence of a SDH2-3-like gene in the moss Physcomitrella patens has drawn our attention because SDH2-3 has been described as a seed-specific expressed gene in angiosperms, and mosses do not have seeds. We confirmed the SDH2-3-like gene is expressed and increases under osmotic stress, in contrast to saline stress, desiccation and high ABA content. Moreover, we determined that Physcomitrella SDH2-3 promoter lacks significant activity in Arabidopsis, either in seeds or vegetative tissue. These results indicate that the transcriptional regulation of this gene in Physcomitrella evolved in an independent way as compared to Arabidopsis.
Caracterización de los genes MIT1 y MIT2 de Arabidopsis Thaliana que codifican para transportadores mitocondriales de hierro
(2021) Vargas Pérez, Joaquín Ignacio; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Entre los micronutrientes esenciales para las plantas, el hierro es aquel que se requiere en mayor abundancia ya que es componente de cofactores como hemo y centros hierro azufre, que participan en procesos como la fotosíntesis y la respiración, entre otros. Importantes avances han permitido conocer los mecanismos que rigen la homeostasis del hierro a nivel fisiológico en las plantas, sin embargo a nivel subcelular existen aún muchas interrogantes. En este contexto, las mitocondrias son organelos con un alto requerimiento de hierro ya que albergan parte de la ruta de síntesis de centros hierro azufre y utilizan numerosos cofactores de hierro en la cadena transportadora de electrones, que en total suman al menos 9 hemos y 13 centros hierro azufre, por lo que la función mitocondrial y el metabolismo del hierro se encuentran estrechamente relacionados. Se ha estudiado poco la homeostasis del hierro mitocondrial en plantas y poco se sabe de los transportadores involucrados. Recientemente fue descrito el primer transportador de hierro mitocondrial en plantas, llamado Mitochondrial Iron Transporter (MIT) en Oryza sativa y codificado por un gen esencial. En base a este transportador identificamos dos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, At1g07030 (MIT1) y At2g30160 (MIT2). La expresión de estos genes en levaduras mutantes en los transportadores mitocondriales de hierro de alta afinidad les permite a estas levaduras crecer en medio deficiente en hierro, lo que sugiere fuertemente que MIT1 y MIT2 transportan hierro a la mitocondria en levaduras. Para caracterizar la función de MIT1 y MIT2 se obtuvieron 3 líneas homocigotas mutantes para MIT1 y 2 líneas homocigotas mutantes para MIT2, y ninguna de ellas presentó alteraciones en su fenotipo. Además la segregación del alelo mutado en la descendencia de plantas heterocigotas tampoco mostró alteraciones. Estos resultados sugieren que ambos genes son redundantes, lo que fue confirmado al cruzar líneas mutantes nulas mit1 y mit2 y no poder obtenerse dobles homocigotas mutantes. Este resultado demostró además que la función MIT es esencial en Arabidopsis. Al cruzar una mutante nula de MIT2 y una “knockdown” de MIT1 fue posible obtener plantas dobles homocigotas mutantes que en la primera generación expresaban un 10-20 % de MIT1. Estas plantas resultaron ser viables y presentaron múltiples alteraciones fenotípicas: embriones con tres cotiledones, retraso en la germinación, en el crecimiento post-germinativo y durante todo el desarrollo. Además, se encontraron anormalidades morfológicas en semillas, hojas, flores y tallos. Parte de estas alteraciones podría explicarse directamente por una disfunción mitocondrial generada por deficiencia de hierro en el organelo, lo que se sustenta en la inducción de genes marcadores de respuesta a perturbación/estrés mitocondrial. Otra parte de las alteraciones podría estar relacionada con un efecto indirecto de la perturbación mitocondrial sobre la homeostasis de auxina. El análisis de los datos transcriptómicos revela que estas plantas tienen probablemente reprimida la adquisición de hierro, la síntesis de cumarinas, la formación de la banda de Caspari, la suberización y el desarrollo de los pelos radiculares. Y tienen aumentada la expresión de genes relacionados con desarrollo y mantención de meristemas, formación y límites de órganos, desarrollo de flores. Curiosamente estas plantas dobles homocigotas mutantes recuperaron un fenotipo normal en la siguiente generación, lo que se correlaciona con un aumento de la expresión de MIT1 (70% a nivel de transcrito y 30% a nivel de proteína, respecto de plantas silvestres), probablemente debido al mecanismo descrito de “supresión de T-DNAs intrónicos”. Estas plantas “compensadas” no son diferentes de plantas silvestres en actividad mitocondrial, en el proteoma mitocondrial y en el transcriptoma.
Characterization of the MYB60 Gene of Phaseolus vulgaris and its Role in Regulating Stomatal Aperture
(2024) Martínez Barradas, Vera Isabel; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal
In this thesis the Phaseolus vulgaris MYB60 gene was characterized, and it is pointed as a promising candidate to improve its tolerance to drought stress. The specific objectives were: Characterize the ‘Zorzal’ cultivar physiological and yield response to drought stress in greenhouse. Identify, clone, and characterize the MYB60 gene of Phaseolus vulgaris orthologous to Arabidopsis thaliana including its coding region and promoter. Establish an in vitro regeneration protocol for the “Zorzal” common bean cultivar and design gRNAs that can be furtherly used for its edition. Zorzal presented physiological traits associated with drought tolerance. However, these traits are insufficient to maintain a stable yield under severe drought stress at the pre-flowering stage.Phaseolus vulgaris has a PvMYB60 ortholog gene to the MYB60 of Arabidopsis thaliana, with stomata-specific expression that is involved in promoting stomatal aperture.An in vitro regeneration method was developed that allows successful fertile plant regeneration of ‘Zorzal’ common bean by direct organogenesis from embryonic axis and embryonic apical meristem explants, with regeneration rates of 58.3 and 21.1% respectively, that together with the designed gRNAs provide a potential tool for genetic manipulation of Zorzal cultivar and common bean in general.
Complejidad de los efectos no letales de depredadores y su transmisión en tramas tróficas : experimentos en terreno y laboratorio con organismos intermareales.
(2013) Manzur Castillo, Tatiana; Navarrete C., Sergio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las interacciones depredador-presa han sido ampliamente reconocidas como un factor crítico en la dinámica de sistemas ecológicos, reconocimiento que se ha basado primordialmente en el aspecto letal de la depredación (i.e. cuantas presas son consumidas por el depredador). Sin embargo, en todos los sistemas naturales los depredadores también pueden afectar la demografía, distribución y evolución de las especies presa a través de los costos de las respuestas antidepredatorias desplegadas para reducir su susceptibilidad a la depredación, respuestas que se entienden como \201Cefectos no letales\201D de los depredadores (ENL). Además de influir fuertemente sobre la dinámica de las poblaciones presa, los ENL de los depredadores pueden también propagarse a través de la trama trófica como efectos indirectos mediados por rasgo (EIMR), afectando la estructura, diversidad y las dinámicas de comunidades completas. El escape activo es una de las respuestas antidepredatorias ampliamente reportadas en diversos taxa marinos. Para que un escape sea exitoso, las presas deben ser capaces de detectar y evaluar el riesgo de depredación idealmente antes de un contacto físico, utilizando señales o información provenientes del depredador o del medio ambiente. La distancia a la que una presa reacciona a la presencia de su depredador (distancia de detección), la extensión espacial y la duración de la respuesta de escape, junto con las tasas de encuentro entre depredador y presa son determinantes de la escala espacio-temporal del ENL del depredador en un sistema y de la importancia ecológica que dicho efecto tendrá a escalas o niveles de organización mayores (e.g. poblacional). No obstante, la aproximación metodológica que han empleado la mayoría de los trabajos que estudian ENL y su transmisión a otros niveles tróficos raramente ha considerado en forma explícita o implícita la escala \2018natural\2019 de las interacciones, lo que podría redundar en la problemática de extrapolar los resultados de manipulaciones experimentales a lo que ocurre efectivamente en la naturaleza. Por otro lado, la expresión de respuestas antidepredatorias supone un costo para las presas que puede manifestarse como una reducción en sobrevivencia, crecimiento o reproducción y, por lo tanto, es esperable que estas respuestas sean rápidas, flexibles (reversibles), especificas y conmensurables con el nivel de riesgo real, minimizando dichos costos. Sin embargo, pocos son los estudios que han cuantificado directamente los costos de estas respuestas y cómo estos pueden influenciar la magnitud y dirección de los efectos indirectos de los carnívoros sobre el nivel trófico basal transmitidos mediante cambios conductuales de los herbívoros. En esta tesis estudiamos los ENL de un depredador y su transmisión en tramas tróficas utilizando como sistema de estudio una trama trófica de tres niveles en el intermareal rocoso. Mediante combinación de manipulaciones experimentales en terreno y laboratorio se investigaron los ENL del depredador asteroideo Heliaster helianthus sobre rasgos de dos consumidores intermedios, el equinoideo Tetrapygus niger y el gastrópodo Fissurella limbata, así como la potencial transmisión de dichos efectos a algas (Ulva sp.) en el nivel trófico basal. El estudio evaluó la escala espacial y temporal en que ocurren estas interacciones, el efecto de estas escalas sobre la interpretación de manipulaciones experimentales, y los costos energéticos que conllevan estas respuestas para las presas. Se demostró que T. niger detecta a Heliaster a través de señales químicas difundidas en el agua hasta distancias de 50 cm y que la distancia recorrida en un escape es de alrededor de 40 cm. Es esperable entonces que el efecto del riesgo de depredación sea variable espacialmente. Manipulaciones experimentales de laboratorio demostraron que las respuestas dependen fuertemente del tiempo de exposición al riesgo y del tamaño del acuario en que se realizan las manipulaciones. Aunque se observaron algunos cambios de corto plazo en el forrajeo de los erizos en presencia de Heliaster, no se evidenció transmisión del ENL sobre Ulva sp. Finalmente, se demostró que en presencia del depredador, F. limbata aumentó rápidamente el consumo de oxígeno, las tasas de movimiento y las distancias recorridas, pero al contrario de muchos estudios anteriores en otros sistemas, F. limbata tendió a aumentar su actividad de forrajeo. En conjunto, los resultados sugieren que la respuesta antidepredatoria de esta presa es energéticamente costosa y que podría compensarse con un mayor consumo de algas. En general, mi estudio ilustra la importancia de cuantificar las escalas espacio-temporales de los ENL y la complejidad de cuantificar su transmisión a otros niveles tróficos en manipulaciones experimentales.
Considering local knowledge in adaptive capacity of local communities at the land-sea interface
(2023) Barceló Carvajal, Matías Paulo; Gelcich, Stefan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Globally, coastal communities are facing changes and threats to biodiversity and food security. A major driver of change relates to declining productivity of fisheries and agriculture in coastal areas that depend on land and sea. Terrestrial and marine ecosystems provide diverse benefits to people through ecosystem services, such as food supply, coastal protection, climate regulation and cultural experiences. Since land-sea interactions can negatively affect the livelihoods of communities, it is important to understand how this interaction affects different ecosystem services at the land-sea interface and, consequently, human well-being. One way that coastal communities cope with these changes is through their adaptive capacity, i.e., their ability to respond to and anticipate change. An important indicator of adaptive capacity is local knowledge, which can help to cope with environmental threats that negatively affect natural resources. The objectives of this thesis are i) to identify approaches, tools and knowledge gaps on the study of land-sea interactions in their relationship with ecosystem services; ii) to assess the relationship between local knowledge, values and livelihoods to identify emerging synergies or trade-offs in this relationship; and iii) to assess how different dimensions of adaptive capacity, including local knowledge, determine the adaptive capacity of coastal communities. For the first objective, a systematic literature review of publications was conducted through Web of Science, using keywords on land-sea interaction. For objectives two and three, we conducted semi-structured interviews in local communities in the Valdivian coast, southern Chile. We assessed local knowledge, values and livelihoods. In addition, we assessed dimensions of adaptive capacity such as agency, social capital, institutions, local knowledge and assets, to determine their role in past and hypothetical future responses to resource depletion scenarios. The systematic review identified 166 publications. The results indicate that the main disciplines that have investigated land-sea interactions were biogeochemistry and ecology, with a focus on nutrients. Regarding ecosystem services, supporting and regulating services were the most investigated, with urbanization and agricultural and forestry effluents as the main topics of study. On the other hand, we highlight the low number of studies that include management strategies and social components in land-sea interaction. Regarding the second objective, the results show heterogeneity in the relationship between values and livelihoods: there are communities that may lose knowledge and values when they expand their livelihoods and communities that do not. Certain types of livelihood diversification strategies may result in constraints that can affect knowledge transmission and differences in the type of values. Finally, the results of objective three show the critical role of local knowledge in adaptive capacity in past and future responses to hazards that may affect resource-dependent local communities. These results highlight the importance of including local knowledge in an adaptive capacity framework. Our results demonstrate the knowledge gaps that exist at the land-sea interface and the importance of beginning to understand the role of local knowledge in the adaptive capacity of coastal communities in order to improve resource management practices at the land-sea interface and move towards more sustainable futures.
Control of motivation for palatable food by kappa opioid receptor signaling and the neuropeptide Orexin-A
(2023) Sandoval Caballero, Carolina Loreto; Pérez Leighton, Claudio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Eating is a motivated behavior that provides nutrients to allow life. Animals evolved to perceive food as a positive reinforcer, resulting in increased motivation for food when the animal is hungry and decreased motivation when it is satiated. Motivation evolved to seek and eat food in an environment of food scarcity; however, it can become maladaptive in an environment with plenty food access, favoring excessive eating, weight gain, and obesity. Understanding the neuronal mechanisms regulating food motivation could improve therapies against obesity.Opioids and the hypothalamic Orexin/Dynorphin neurons are part of the brain mechanisms that regulate food intake and motivation for food. Opioids bind mainly to three G-protein coupled receptors (kappa, mu, and delta), which are expressed in brain regions that regulate food intake and motivation. Still, the contribution of each opioid receptor to food intake and motivation for food is unclear. The Orexin/Dynorphin neurons co-release the excitatory neuropeptides Orexins (e.g., Orexin-A and Orexin-B) and the inhibitory opioids Dynorphin (e.g., Dynorphin-A 1-13) into different areas, including the Oxytocin neurons from the paraventricular hypothalamic nucleus. The effects of Orexin and Dynorphin peptides in eating behavior are brain-site specific. For example, in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 increases and Orexin-A decreases palatable food intake (i.e., tasty food, generally high in sugars and fats). Still, the opposite effect is observed in the ventral tegmental area. Dynorphin-A1-13 binds mainly to the kappa opioid receptor, which is expressed in the anorexigenic oxytocin neurons of the paraventricular hypothalamic nucleus; however, whether inhibition of oxytocin neurons is involved in the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 in the paraventricular hypothalamic nucleus is unknown. Also, in this brain region, Orexin-A blocks the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13. Still, it is unclear whether these effects are mediated by changes in motivation for palatable food and whether the endogenous kappa opioid receptor signaling in the paraventricular hypothalamic nucleus regulates motivation for food. We hypothesize that in the paraventricular hypothalamic nucleus, Dynorphin-A1-13 signaling through the kappa opioid receptor promotes motivation for sucrose, and Orexin-A inhibits this behavior. We evaluated this hypothesis through four specific aims. [1] To determine through a meta-analysis the effects of kappa, mu, and delta opioid receptor ligands on food intake and motivation. We found that: (1) agonists increased food intake after central injections while antagonists decreased food intake after central and peripheral injections. (2) We did not find differences between the effects of opioid receptor ligands on standard rodent food intake after injections in the paraventricular hypothalamic nucleus compared to other brain sites. (3) Mu agonists had the strongest orexigenic effect compared to kappa and delta agonists, with the most significant effect on fat intake. (4) Whereas only centrally administered kappa antagonists reduce feeding, peripherally administered antagonists for all opioid receptor subtypes reduce feeding; (5) peripheral administration of antagonists decreases motivation for food regardless of food type. [2] To determine whether in the paraventricular hypothalamic nucleus signaling through kappa opioid receptor mediates the ability of Dynorphin-A1-13 to increase motivation for sucrose. We assessed motivation for sucrose using a progressive ratio schedule in which mice must perform work licks to obtain sucrose. After each sucrose reward obtention, there was a 20 sec time-out period in which licks were recorded, but sucrose could not be obtained. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to the vehicle: (1) bilateral administration of the kappa opioid antagonist nor-binaltorphimine increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work and time-out licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. These effects were also found after subcutaneous administration of nor-binaltorphimine. (2) Unilateral Dynorphin-A1-13 administration increased the time to obtain sucrose rewards and decreased sucrose work licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing time-out licks. (3) Bilateral Dynorphin-A1-13 administration did not change the time to obtain sucrose rewards. However, it strongly decreased sucrose work licks in the early and middle stages of the sucrose progressive ratio. Also, nor-binaltorphimine did not block Dynorphin-A1-13 effects. Finally, we could not downregulate the expression of the kappa opioid receptor in the paraventricular hypothalamic nucleus and thus, these effects in motivation for sucrose were not performed. [3] To determine whether oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus express the kappa opioid receptor and whether blocking the kappa opioid receptor activates Oxytocin neurons in this brain region. Published data demonstrated that the kappa opioid receptor is expressed in oxytocin neurons in the paraventricular hypothalamic nucleus. Thus, we assessed whether nor-binaltorphimine activates oxytocin neurons and decreases food intake in mice. We found that nor-binaltorphimine administration in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased cafeteria diet intake and abolished the negative correlation between the percentage of active caudal oxytocin neurons and cafeteria diet intake established after vehicle injection. [4] To determine whether activation of the kappa opioid receptor by Dynorphin-A1-13 and orexin receptors by Orexin-A in the paraventricular hypothalamic nucleus have opposing effects on motivation for sucrose. We found that in the paraventricular hypothalamic nucleus and relative to vehicle (1) Unilateral Orexin-A administration increased sucrose work and time-out licks in the middle and late stages of the sucrose progressive ratio without changing the time to obtain sucrose rewards and time-out licks. (2) Orexin-A decreases the demotivational effects of Dynorphin-A1-13.We conclude that signaling through orexin and opioid receptors modulates feeding behaviors and motivation for food. Those effects depend on variables including the dose and administration route of the drug, food tested, and circadian period in which the outcomes were measured. Dynorphin-A1-13 and nor-binaltorphimine in the paraventricular hypothalamic nucleus decreased sucrose work licks, and Orexin-A blocked the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 over time. We reasoned that the demotivational effects of nor-binaltorphimine could involve the activation of anorexigenic oxytocin neurons, and the demotivational effects of Dynorphin-A1-13 could be explained by their signaling through other receptors besides the kappa opioid receptor, such as Mu opioid receptor. We conclude that during the active phase of the mice, Orexin-A potentiates the orexigenic mechanisms that are naturally active in mice and increases locomotion and motivation. Consequently, the orexigenic effects of Dynorphin-A1-13 could not be detected because orexigenic mechanisms reached a ceiling effect. Thus, instead of promoting motivation for sucrose, Dynorphin-A1-13 prompts allodynia that decreases feeding and motivated behaviors.
Coupling cell communication and optogenetics: implementation of a light-inducible intercellular system in yeast
(2023) Rojas Jorquera, Vicente Alberto; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La comunicación celular es un fenómeno extendido en biología, permitiendo la transmisión de información acerca de las condiciones del entorno. Con el fin de entender cómo la comunicación celular modula procesos biológicos relevantes, diferentes sistemas sintéticos basados en inducción química han sido exitosamente desarrollados. En este trabajo, se acopló la comunicación celular y la optogenética en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La aproximación consiste en dos poblaciones conectadas por la producción dependiente de luz de la feromona factor-α en un tipo celular, que induce la expresión génica en el otro grupo de células. Después de la caracterización individual de tres variantes de ambas cepas, el sistema intercelular optogenético fue evaluado combinando las diferentes células bajo condiciones contrastantes de iluminación. Usando luciferasa como gen reportero, co-cultivos específicos a una proporción 1:1 muestran activación de la respuesta bajo luz azul constante, lo que no fue observado para las mismas mezclas crecidas en oscuridad. Entonces, el sistema fue evaluado en varias transiciones oscuridad/luz azul, donde el nivel de respuesta varia dependiendo del momento en el que la iluminación fue entregada. Además, la amplitud de la respuesta puede ser ajustada modificando la proporción inicial entre ambos tipos de cepa. También, células expresando todas las partes del circuito sintético se generaron para verificar si la separación de actividades biológicas mejora el rendimiento general del sistema. En ese contexto, el sistema de dos poblaciones mostró mayores veces de inducción en comparación con cepas autónomas. Esta exitosa implementación del sistema intercelular optogenético abrió la oportunidad de expandir el repertorio de las cepas de levadura involucradas variando componentes de la vía de señalización como reguladores negativos y promotores de respuesta a feromona. Así, se obtuvieron diversas versiones del sistema, que muestran un amplio rango de niveles de respuesta bajo regímenes de inducción por luz. En general, estos resultados demuestran que la información externa de la luz es propagada a través de una molécula de señalización difusible para modular la expresión génica en un sistema sintético de células microbianas, lo que pavimentará el camino para estudios que permitan el control optogenético de dinámicas a nivel de población.
Descifrando la historia evolutiva de Gracilaria Chilensis a través del Océano Pacífico Sur
(2022) Huanel Oyarzún, Oscar Roberto; Faugeron, Sylvain Wielfrid; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Gracilaria chilensis es la principal alga cultivada en Chile, distribuyéndose desde Caldera (27°S) hasta Raúl Marín Balmaceda (43°S). Estudios de genética poblacional y filogeografía previos indican que las poblaciones chilenas de G. chilensis son caracterizadas por una reducida diversidad genética asociada a la sobreexplotación de las praderas naturales ocurrida hace unos 50 años y/o el efecto fundador durante la colonización de Chile a fines del Último Máximo Glacial. Gracilaria chilensis es originaria de Nueva Zelanda, donde coexiste con G. transtasmanica para la cual se ha propuesto una reciente introducción debido que es hallada principalmente cerca de puertos en la Isla Norte, sin embargo, la distribución de ambas especies a lo largo del archipiélago aún no está clara. Para entender mejor el estado actual del recurso genético de G. chilensis en Chile es necesario entender como estos dos procesos han determinado la historia evolutiva de este importante recurso algal. En la presente tesis, se evaluó la distribución e historia evolutiva de Gracilaria en Nueva Zelanda utilizando el marcador nuclear Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) (Capítulo 1), y cómo los procesos antes mencionados han influenciado la arquitectura genética de G. chilensis en Chile utilizando 2.232 SNP (Capítulo 2). Nuestros resultados confirman que G. chilensis tiene una amplia distribución a través de archipiélago de Nueva Zelanda, con una fuerte estructuración geográfica concordante con el efecto de los ciclos glaciales-interglaciares, y los principales limites biogeográficos descritos para esta región. Por otro lado, G. transtasmanica presentó una distribución parchosa, sin un patrón de estructuración de su diversidad genética, pero con señales de un crecimiento poblacional post glacial soportando una antigua presencia en Nueva Zelanda. Los análisis de ABC mostraron que la actual distribución de G. chilensis a través del océano Pacífico Sur resultó de dos eventos de colonización independientes hace unos 20,000 años atrás. Para Chile, los análisis de ABC además infirieron un cuello botella mucho más reciente asociado a la sobreexplotación de las praderas naturales G. chilensis en la década de los 70s, seguido por un rápido crecimiento poblacional posiblemente asociada a la expansión de los cultivos propagados clonalmente post sobreexplotación. Nuestro estudio reveló que la historia evolutiva de G. chilensis, ha sido marcada por recurrentes cuellos de botellas demográficos asociados a los ciclos Glaciales-Interglaciares del Pleistoceno, colonizaciones a largas distancias y perturbaciones antrópica (i.e., sobrecosecha), planteando importantes desafíos en el manejo del recurso genético erosionado de un alga intensivamente cultivada, y que se encuentra en etapas tempranas de domesticación.
Development and morphological evolution in flowers : ontogenetic integration patterns and structural factors in the floral meristem.
(2019) Chinga Chamorro, Javiera Beatriz; Pérez Trautmann, María Fernanda; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los patrones de diversificación floral están determinados por cambios tanto en la presión selectiva mediada por polinizador como en las trayectorias ontogenéticas. Particularmente, cambios en las proporciones entre órganos florales se asocian con cambios rápidos en el síndrome de polinización. Estos cambios han sido estudiados principalmente por tres aproximaciones: la co-variación entre órganos florales (integración morfológica), las tasas de crecimiento de cada órgano floral (alometría morfológica) y el cambio evolutivo en la temporalidad del desarrollo (heterocronía). En esta tesis, se estudiaron los patrones ontogenéticos de integración, alometría y heterocronía y su relación con la diversificación mediada por polinizador en el género Schizanthus. Tanto la integración como la alometría fueron medidos usando una división de dos estadios ontogenéticos o realizando un rastreo por rangossolapados de tamaños de yema creciente, para contestar las siguientes preguntas: 1) cómo la integración y las pendientes alométricas varían a lo largo de la ontogenia; 2) cómo estas variaciones se relacionan con los patrones de diversificación mediada por polinizador y 3) su relación a lo largo de la ontogenia y entre especies. Respecto a la heterocronía, análisis cuantitativos de tamaño y forma en un amplio rango de estadios ontogenéticos fueron usados para construir las trayectorias ontogenéticas y describir su relación con los patrones de diversificación mediada por polinizador en el género. Este estudio encontró que tanto la integración como la alometría variaron a lo largo de la ontogenia y entre las especies. Estos parámetros tendieron a co-variar a lo largo de la ontogenia, dado que eventos de baja integración tendieron a correlacionarse con una mayor diferencia de pendientes alométricas entre rasgos. Sin embargo, esta relación varió entre especies, sugiriendo que existe una relación biológica mucho más compleja que la sugerida la relación matemática entre integración y alometría a lo largo del desarrollo. Los patrones de integración y alometría durante el desarrollo fueron congruentes con los patrones de diversificación mediada por polinizador en el género: estructuras reducidas que perdieron su función en el proceso de polinización tienden a estar desacopladas del resto de la corola y tener menores pendientes alométricas durante el desarrollo. Mientras que estructuras más reducidas presentaron menores pendientes alométricas, estas no estuvieron más desacopladas, mostrando nuevamente que la relación entre integración y alometría durante el desarrollo es más compleja de lo esperado. Respecto a la heterocronía, los patrones de diversificación floral en el género se produjeron por transiciones a morfologías pedomorficas y peramorficas. Estas transiciones ocurrieron mediante diferentes combinaciones de procesos ontogenéticos (cambios en la aparición del rasgo o en sus tasas de crecimiento), los cuales pueden presentar efectos compensatorios a lo largo del desarrollo. De forma interesante, estructuras reducidas que no presentaron marcados patrones de desacople durante el desarrollo resultaron encontrarse más afectadas por cambios en su aparición, evidenciando que los patrones de integración se encuentran más afectados por cambios en las tasas de crecimiento. En conclusión, la integración y la alometría ontogenética y los cambios heterocronicos son procesos interrelacionados que varían a lo largo de la ontogenia, presentando efectos compensatorios y donde los cambios entre especies se relacionan con la diversificación floral mediada por polinizador.
Dispersión larval y patrones de conectividad en peces litorales de Chile Central.
(2013) Mansur, Lidia Elena; Ojeda Rossi, Federico Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En estudios de ecología marina, uno de los temas centrales es la conectividad o intercambio de individuos entre poblaciones marinas. Para muchas especies bentónicas con ciclos de vida complejo, este intercambio ocurre en los estadios larvales pelágicos. El pequeño tamaño de las larvas y su comportamiento, la dificultad en realizar seguimientos desde la eclosión de huevos hasta el asentamiento y las condiciones oceanográficas en las cuales se desarrollan estas especies, dificultan el entendimiento del fenómeno. No obstante esto, en las últimas décadas, a partir de aproximaciones directas e indirectas utilizando técnicas geoquímicas y genéticas, es posible determinar el rango geográfico de las poblaciones de especies bentónicas. Considerando los peces costeros, numerosos estudios sugieren que el rango de las poblaciones varía desde pocos a cientos e incluso miles de kilómetros. En este contexto, identificar la escala espacial en la que las poblaciones están demográficamente desconectadas es crucial para determinar, por ejemplo, áreas protegidas o estrategias de manejo. En el ambiente intermareal rocoso de la costa central de Chile, el ensamble de peces está caracterizado por dos componentes, especies “residentes” (luego de reclutar permanecen en el intermareal) y “temporales” (luego de alcanzar cierto tamaño migran al ambiente submareal). Considerando que representa un ambiente perturbado y que se encuentran especies de interes para la pesca artesanal, se plantea la necesidad de abordar estudios de conectividad. Para lo cual, se hace necesario conocer previamente la biología y ecología en la fase larval y recluta; como así también, realizar estudios que involucren una larga extensión espacial. El objetivo central de la tesis es analizar la capacidad de dispersión de peces litorales con diferentes estrategias de vida (residentes y temporales), de Chile central y determinar cuales son los mecanismos biofísicos que subyacen al fenómeno. Se seleccionaron las especies mas representativas de ambas estrategias de vida, Helcogrammoides chilensis (especie residente) y Girella laevifrons (especie temporal). En primer lugar se estimó la dispersión larval a partir de la determinación del período de permanencia larva en el plancton (PLD), la que permitió establecer como distancia máxima a la que podrían dispersar en 200 km. A su vez se determinaró la sincronía de los eventos de reclutamiento con las fases lunares. Considerando la distancia de dispersión, se realizó el análisis de la estructura genética en seis localidades ubicadas en el rango de dispersión a partir del análisis de ADN nuclear (AFLP). Se pudo determinar que los peces residentes presentan estructuración a distancias de hasta 10 km y que la dispersión está limitada por barreras oceanográficas principalmente la presencia de cuerpos de agua dulce. Por el contrario, las especies temporales con huevos y larvas pelágicos no presentan estructuración en el rango geográfico del estudio. Dicho fenómeno se explica en que las larvas al ser liberadas al plancton lejos de la costa, no se ven afectadas por eventos o barreras oceanográficos costeros que producen retención larval. Por útlimo se se analizó una serie temporal de 15 años en 3 localidaes para determinar cuales son los factores (exógenos o endógenos) que explican la dinámica de las poblaciones. Como resultado fue posible generar modelos simples para ambas especies y corroborar lo encontrado en el análisis genético en cuanto a la escala en que se pueden individualizar poblaciones.
Distribución potencial y posibles rutas de migración del castor norteamericano (Castor canadensis) en su rango invasivo utilizando el concepto de nicho hutchinsoniano.
(2014) Corcoran Barrios, Derek Andrew; Jaksic Andrade, Fabián; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Una de las preguntas más interesantes en ecología, es qué determina el rango de una especie. En este sentido, uno de los conceptos teóricos más útiles para estudiar tanto los límites como la estructura interna del rango de una especie es el Nicho Ecológico. Su concepto se ha visto redefinido en varias oportunidades, sin embargo un punto en común para estas definiciones es la búsqueda de cómo podemos predecir el hábitat de una especie. Recientemente, surge una metodología capaz de predecir el rango de una especie: la modelación de distribución de especies basado en el concepto de nicho Grinelliano. Esta herramienta ha permitido mejorar la forma en que entendemos la distribución de las especies al generar distribuciones potenciales frente a distintos escenarios. Un siguiente paso en el estudio de la estructura interna de la distribución de una especie es la utilización de su adecuación biológica, a través de la generación de modelos a partir de nicho Hutchinsonianos espacialmente explícitos (biótopos). El objetivo general de esta tesis es el modelar el nicho Hutchinsoniano del castor en la isla de Tierra del fuego, caracterizar la estructura de su rango, proyectarlo al continente y utilizar esta información para modelar el rango y rutas de dispersión de la especie para Sudamérica.
Efectos de la fragmentación sobre la distribución de especies arbóreas en el Parque Nacional Fray Jorge : importancia de los atributos ecofisiológicos
(2013) Salgado Negret, Beatriz Eugenia; Pérez Trautmann, María Fernanda; Armesto, Juan J.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Engineering multicellular domains in M. polymorpha from internal phytohormone gradients
(2022) Cerda Rojas, Ariel; Federici, Fernán; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas. Departamento Genética Molecular y Microbiología
La biología sintética es un campo multidisciplinario emergente que involucra a la biología, la ingeniería, y la física en el desarrollo de abstracciones, herramientas y modelos para diseñar sustratos biológicos de manera reproducible, escalable y eficiente. Uno de los temas más desafiantes corresponde a la programación de comportamientos emergentes y procesos de autoorganización en sistemas multicelulares, campo denominado ingeniería morfogenética. Las plantas son una plataforma atractiva para estudiar cómo la formación de patrones contribuye al desarrollo y la morfogénesis, así como para definir principios morfogenéticos. Un modelo atractivo para abordar estos desafíos y reducir la brecha entre la facilidad de manejo de los organismos unicelulares y la complejidad de las plantas superiores es la hepática Marchantia Polymorpha (Marchantia). Marchantia presenta características prometedoras para la biología sintética, como un ciclo de vida más corto, una fase de gametofito haploide dominante, un genoma secuenciado con baja redundancia genética, una propagación clonal sencilla y robusta a través del subcultivo de gemas y una transformación de alta eficiencia para la manipulación genética. La ingeniería morfogenética en plantas debe enfrentar constantemente la escasez de herramientas fundacionales y componentes genéticos estandarizados, y su progreso se ha visto retrasado por la falta de información sobre los elementos funcionales de ADN. En este trabajo, nuestro objetivo es crear funciones elementales para la ingeniería de patrones en plantas mediante el establecimiento de dominios artificiales de estados celulares, utilizando gradientes internos (fitohormonas) como entradas para nuestros circuitos formadores de patrones. Para lograrlo, creamos nuevas herramientas para la construcción rápida, modular y combinatoria de circuitos genéticos en plantas, probamos elementos genéticos para construir estos circuitos y propusimos formalismos matemáticos para el desarrollo de modelos morfogenéticos. Todo esto se hizo utilizando Marchantia y sus ventajas como chasis para la biología sintética.
Especialización en micorrizas: factores ecológicos e implicancias macroevolutivas
(2019) Mujica Pérez de Castro, María Isabel; Pérez Trautmann, María Fernanda; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El mutualismo ha tenido un papel central en la ecología y evolución de la biodiversidad. Esta interacción se caracteriza por presentar una gran variación en el nivel de especialización, que, debido a sus potenciales efectos a escala evolutiva y ecológica, es de gran interés para biólogos evolutivos y ecólogos. La especialización podría ser favorable si resulta en una mayor eficiencia en el intercambio de recursos y/o servicios, pero al mismo tiempo podría implicar una menor capacidad de interactuar con otras especies y así persistir frente a cambios ambientales, llevando a los linajes especialistas a un “callejón sin salida” evolutivo. Pese a sus posibles desventajas, existen numerosos casos de especialización en la naturaleza, lo que sugiere que, bajo ciertas condiciones ecológicas, la especialización podría ser ventajosa o neutral. Para entender cuáles son las implicancias evolutivas de la especialización y a una escala ecológica, cuáles son aquellos factores que promueven la especialización, en esta tesis se estudió la especialización en las micorrizas, una asociación entre plantas y hongos del suelo que está presente en la mayoría de las plantas terrestres y presenta una gran variación en el nivel de especialización. De esta manera, en esta tesis se abordaron las siguientes preguntas (1) ¿Qué efecto tiene la especialización micorrícica sobre las tasas de diversificación de las plantas? (2) ¿Qué factores ambientales promueven la especialización micorrícica? Para responder la primera pregunta, el enfoque se centró en la historia evolutiva de las micorrizas, estudiando los cuatro tipos de micorriza a lo largo de la evolución de las plantas. Con esto, se evaluó la relación entre la diversidad de tipos de micorrizas y las tasas de diversificación de las familias de plantas con semillas, demostrándose que una mayor diversidad de tipos de micorrizas se relaciona con mayores tasas de diversificación. Estos resultados apoyan la hipótesis de la especialización como una estrategia desfavorable a escala evolutiva y corroboran la importancia de las asociaciones micorrícicas en la evolución de las plantas. Para la segunda pregunta, en cambio, nos centramos en un tipo particular de micorrizas, las micorrizas de orquídeas, donde se estudió el papel de los factores ambientales, específicamente los nutrientes del suelo, en la especialización micorrícica. Utilizando una especie de orquídea endémica de Chile, Bipinnula fimbriata, se evaluó (1) el efecto de la disponibilidad de nutrientes en la comunidad de hongos asociados a plantas adultas de B. fimbriata en una población natural y (2) el efecto de los nutrientes en el inicio de la asociación simbiótica, que ocurre en el encuentro del hongo micorrícico con la semilla de la orquídea. Ambos estudios mostraron que los nutrientes tienen un papel clave en las asociaciones micorrícicas de B. fimbriata, tanto en plantas adultas como en la etapa de la germinación, mostrando además que en plantas adultas los nutrientes pueden afectar indirectamente a toda la comunidad de hongos asociados (incluidos hongos micorrícicos y no micorrícicos). Los resultados sugieren además que el efecto de los nutrientes en la especialización micorrícica depende de la escala espacial, en el caso de poblaciones naturales, y de la identidad del hongo involucrado, en el caso de la germinación simbiótica. Esta tesis aporta con nuevos conocimientos sobre la interacción entre orquídeas y hongos, abre numerosas preguntas para futuras investigaciones y contribuye a la comprensión de la importancia de la asociación con hongos en la estructuración de las comunidades y la evolución de las plantas.
Estudio de la biogénesis y expresión de mirrorRNAs en el transcriptoma de mamíferos.
(2014) Munita Robert, Roberto Andrés; Gysling Caselli, Katia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Con el advenimiento de nuevas tecnologías se ha descubierto la gran complejidad del transcriptoma de los mamíferos. Se ha reportado la existencia de un tipo especial de transcritos antisentido naturales (NATs), que son perfectamente complementarios a mRNAs sentido a lo largo de varios exones, incluyendo los sitios de unión entre exones. En esta tesis estos transcritos antisentido naturales son llamados mirrorRNAs. Hasta el momento aun existe controversia si los mirrorRNAs son RNAs no codificantes reales o artefactos experimentales. No se han hecho análisis sistemáticos que permitan conocer la abundancia y diversidad de los mirrorRNAs en el transcriptoma humano y tampoco se ha estudiado el mecanismo mediante el cual los mirrorRNAs son generados. En la literatura se han propuesto dos hipótesis para explicar su biogénesis. La primera hipótesis es que estos transcritos son generados por la transcripción bidireccional de un locus y que posteriormente los transcritos antisentido sufren splicing en los sitios no consenso CT-AC, que son los sitios complementarios a los sitios consenso GT-AG. La segunda hipótesis que se ha planteado es que los mirrorRNAs se producen por una actividad RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) que utiliza como molde un mRNA maduro, generando un transcrito antisentido perfectamente complementario. En esta tesis planteamos una tercera hipótesis: Los mirrorRNAs provienen de la transcripción antisentido de pseudogenes procesados presentes en el genoma.
Estudio de la relación secuencia / estructura / función en dominios catalíticos de polimerasas de ADN.
(2013) Slater Morales, Alex William; Melo Ledermann, Francisco Javier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La clasificación de proteínas en familias comienza con el trabajo propuesto por Dayhoff en la década de los 70. Desde entonces la clasificación basada en secuencia ha sido el método principal para el agrupamiento de proteínas. En general las familias proteicas manifiestan una diversidad contenida en sus secuencias, no obstante existen casos conocidos donde la divergencia puede llegar a los límites de la detección por parte de los métodos basados en secuencia. El hallazgo de Chothia y Lesk en la década de los 80 (la estructura es más conservada que la secuencia), permite la introducción de la información estructural en los sistemas de clasificación de proteínas. Sin embargo su uso se vio restringido por la gran diferencia entre estructuras y secuencias disponibles. Pese a que esta diferencia aún existe, en la actualidad es posible encontrar familias de proteínas para las cuales existe una gran cantidad de estructuras resueltas y que además poseen gran divergencia a nivel de secuencia (e.g globinas, polimerasas de ADN). Estas familias constituyen buenos modelos para mejorar nuestro entendimiento de la relación secuencia/estructura/función en proteínas. De particular interés son las polimerasas de ADN, debido a que participan en una función esencial en los sistemas biológicos, constituyen un gen muy antiguo en la historia de la evolución, cuentan con una gran cantidad de estructuras disponibles, y además concentran un interés biotecnológico asociado. Inicialmente, las polimerasas de ADN fueron clasificadas en tres familias (A, B y C) de acuerdo a la similitud a nivel de secuencia con tres genes de polimerasas de E. coli (polA, polB y polC). A principios de los 90, se efectúa la primera revisión de su clasificación, resultando en una extensión a las familias D y X (polimerasas pertenecientes a euriarqueotas y similares a polimerasa beta de humanos, respectivamente). A fines de esta década una nueva extensión de la clasificación se hace necesaria con el descubrimiento de polimerasas involucradas en la reparación de daño por radiación UV (familia Y). En síntesis, actualmente se acepta una clasificación en 6 familias de polimerasas (A, B, C, D, X e Y), mediante un criterio basado en la similitud de sus secuencias únicamente. Miembros de distintas familias comparten muy baja similitud entre ellos, por debajo de los límites de detección confiables. También se ha observado que dentro de una misma familia es posible detectar gran diversidad de secuencias. En la literatura se ha demostrado cuantitativamente que alineamientos de secuencias muy disímiles (porcentaje de identidad de secuencia menor a 30%) contienen un número considerable de aminoácidos mal alineados. En consecuencia, surge el cuestionamiento de la validez de la clasificación actual de las polimerasas de ADN, dado que ésta ha sido construida en base a comparaciones entre proteínas remotamente relacionadas que presentan una baja similitud de secuencia. En contraposición a esta diversidad a nivel de secuencia, el depósito de estructuras cristalizadas de polimerasas revela similitudes importantes a nivel estructural entre enzimas que pertenecen a distintas familias. Por tanto, es posible que existan relaciones entre familias de polimerasas de ADN que aún no han sido descritas debido a una limitación tecnológica en el estudio de tales relaciones. En esta tesis doctoral, se realizó un estudio sistemático de las relaciones estructurales en los dominios catalíticos de polimerasas de ADN utilizando herramientas avanzadas de comparación estructural (i.e. alineamientos estructurales). Considerando que la estructura de las proteínas es más conservada que su secuencia, este tipo de técnica permite indagar en relaciones de similitud estructural y evolutivas de proteínas con alta divergencia a nivel de sus secuencias, como es el caso de las polimerasas de ADN. Además esta información puede ser utilizada para mejorar la relación señal-ruido en alineamientos de secuencia incrementando la sensibilidad y especificidad en la detección de relaciones remotas. Los resultados obtenidos muestran que a nivel de cadenas completas y dominios catalíticos funcionales, la clasificación propuesta en familias sigue siendo válida, aunque la variación estructural observada es mayor que la esperada inicialmente, mostrando que existe diversidad dentro de familias tanto a nivel de secuencias como a nivel estructural. Por otra parte, a nivel de dominios estructurales, las palmas corresponden al dominio más conservado, detectándose relaciones entre las palmas de las familias A,B e Y, mientras que las palmas de las familias C y X forman grupos estructurales independientes. La comparación del dominio de pulgares y dedos muestran que éstos corresponden a los dominios con mayor grado de variación estructural y de secuencia. Adicionalmente, la clasificación de polimerasas de ADN no se respeta cuando se realizan agrupamientos con esta clase de dominios estructurales. Por otra parte se detectaron relaciones cruzadas entre dedos y pulgares de diferentes familias. En el caso de los dedos de la familia A y pulgares de la familia B, los datos obtenidos sugieren que estos segmentos no son análogos estructurales. Por otra parte los dedos de la familia X y pulgares de la familia Y presentan una similitud estructural que además pudo ser comprobada mediante análisis de alineamientos de múltiples secuencias derivados de la estructura. No obstante, esta relación no pudo ser recuperada cuando se emplearon alineamientos de secuencia derivados por métodos tradicionales, mostrando que la estrategia de alineamientos estructurales mejora la relación señal-ruido en la detección de relaciones remotas. Finalmente, los resultados de esta comparación cruzada de dedos de familia X y pulgares de familia Y, sugieren que estos segmentos son análogos estructurales. Por último la información recopilada de las comparaciones estructurales fue resumida en un mapa de relaciones estructurales de polimerasas de ADN donde se muestran no sólo las relaciones a nivel de dominios estructurales, sino también complementada con los dominios accesorios presentes en polimerasas de ADN. La evidencia recopilada, sugiere que las cinco familias de polimerasas para las que se tiene estructura se habrían originado en tres eventos independientes, lo que se fundamenta en la existente de tres grupos estructurales principales: el grupo formado por polimerasas de las familias A, B e Y, las polimerasas de la familia C y las polimerasas de la familia X.
Estudio de los genes VvBSL1 y VvBSL2, que codifican para putativos factores de transcripción, en la respuesta a estrés en Vitis vinifera L.
(2014) Serrano Acevedo, Jennyfer Scarlett; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Vitis vinifera L., es una especie extensivamente cultivada a lo largo de Chile y está expuesta a condiciones de estrés biótico y abiótico muy diversas. Parte importante de los mecanismos adaptativos que permiten a las plantas responder a estrés dependen de cambios transcripcionales. En esta tesis se identificaron dos genes pertenecientes a la familia de factores de transcripción R2R3MYB en V. vinifera, nombrados como VvBSL1 y VvBSL2 por su alta homología con genes de otras especies relacionados a la respuesta tanto a estrés biótico como abiótico. Utilizando RT-PCR en tiempo real, se determinó que VvBSL1 es inducido tanto por la infección por Botrytis cinerea, Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) y salinidad. Esto sugiere que VvBSL1 podría constituir un punto de convergencia para la respuesta a estrés biótico y abiótico. Adicionalmente, los niveles de transcrito de VvBSL2 son aumentados en estrés abiótico como elevada radiación UV-B y salinidad.

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