3.06 Tesis doctorado

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Browsing 3.06 Tesis doctorado by Subject "1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa"

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    Mechanisms involved in the loss of brown adipose tissue in the AGPAT2 deficient mouse.
    (2019) Tapia Ossa, Pablo José; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que participa en la síntesis de triacilgliceroles y glicerofosfolípidos. En la diferenciación de adipocitos (adipogénesis) el almacenamiento de lípidos en gotas lipídicas de los adipocitos tiene un rol fundamental. Mutaciones en el gen codificante para esta enzima generan lipodistrofia congénita generalizada, enfermedad caracterizada por la reducción severa de tejido adiposo blanco y pardo, así como también severas complicaciones metabólicas. Los ratones deficientes para AGPAT2 (Agpat2-/-) nacen con tejido adiposo pardo de morfología y abundancia similar al de ratones normales, sin embargo, este tejido degenera completamente durante los primeros 6 días después de nacer. Las causas de este fenómeno son actualmente desconocidas. La hipótesis de esta tesis es que adipocitos pardos de ratones Agpat2-/- tienen anormalidades transcripcionales que determinan adipogénesis defectuosa y mayor susceptibilidad a muerte celular lipotóxica. Para evaluar esta hipótesis, preadipocitos pardos del tejido adiposo interescapular de ratones Agpat2-/- y tipo silvestre fueron diferenciados adipogénicamente en cultivo celular y comparados en diversos parámetros morfológicos y moleculares. Los cultivos de preadipocitos diferenciados Agpat2-/- presentaron una menor proporción de células cargadas con gotas lipídicas a lo largo de la diferenciación y una expresión disminuida de los reguladores transcripcionales pro-adipogénicos PPARy, PPARα, C/EBPα y PGC1α. Importantemente, los factores de transcripción PRDM16 y C/EBPβ, previamente identificados como mediadores de la diferenciación adipogénica parda, tuvieron niveles normales en los adipocitos pardos Agpat2- /- diferenciados in vitro. Concordantemente, la proteína UCP1, un marcador específico de adipocito pardo maduro, permaneció indetectable en los adipocitos Agpat2-/- diferenciados. Por el contrario, sus niveles fueron fuertemente inducidos en los adipocitos pardos tipo silvestre diferenciados in vitro. El análisis ultraestructural de los adipocitos diferenciados mostró que las mitocondrias de los adipocitos Agpat2-/- diferenciados pardos tienen morfología notoriamente alterada, con crestas de geometría irregular, y una menor asociación física con gotas lipídicas, a diferencia de lo que ocurre en los adipocitos pardos normales diferenciados, que tienen mitocondrias con crestas plegadas en disposición paralela y que están íntimamente asociadas a gotas lipídicas con alta frecuencia. El análisis global del transcriptoma de los adipocitos diferenciados in vitro mostró divergencia significativa en la abundancia del mRNA codificado por varios grupos de genes. Entre estas destacaron, menor expresión de genes relacionados a la acumulación de lípidos y estructura y función mitocondrial, y mayor expresión de genes estimulados por interferón. Estos resultados fueron verificados independientemente por análisis de qRT-PCR. Adicionalmente, los cultivos de adipocitos Agpat2-/- diferenciados presentan menores niveles de Elovl3 y mitoNEET, ambos previamente identificados como reguladores de la diferenciación y función adiposa. Importantemente, la sobreexpresión de estas proteínas por medio de vectores adenovirales, no normalizó la acumulación de gotas lipídicas en adipocitos Agpat2-/- diferenciados, indicando que la diferenciación adipogénica defectuosa dependiente de la carencia de AGPAT2 no es revertida por estos productos génicos. Finalmente, para evaluar la mayor susceptibilidad a muerte celular por lipotoxicidad en adipocitos pardos Agpat2-/-, primero se cuantificó la concentración y composición de ácidos grasos en el plasma de ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con ratones tipo silvestre de la misma edad, mostrando una elevación marcada de todas las clases de ácidos grasos, en particular saturados y monoinsaturados, a partir del segundo día postnatal. Entre los primeros destacó el ácido palmítico, cuya concentración fue ~5 veces mayor en los ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con el tipo silvestre. La incubación de preadipocitos no diferenciados Agpat2-/- y tipo silvestre con ácido palmítico, mostró similares niveles de muerte celular causada por lipotoxicidad. Sin embargo, cuando adipocitos pardos diferenciados in vitro fueron expuestos a ácido palmítico, los cultivos Agpat2-/- presentaron niveles de muerte celular significativamente mayores, cuantificada por cuatro técnicas distintas y complementarias, en comparación con el tipo silvestre, indicado que la carencia de AGPAT2 determina mayor susceptibilidad de los adipocitos a muerte por lipotoxicidad. Tomados en su conjunto, los resultados de esta tesis indican que AGPAT2 es esencial para la diferenciación adiposa parda, determinando perfiles transcripcionales anormales y que los adipocitos diferenciados carentes de esta enzima son más sensibles a altos niveles de ácidos grasos saturados presentes en los ratones Agpat2-/- después de nacer.
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    Mechanisms of lipodystrophy in the AGPAT2 deficient mouse
    (2013) Cautivo Reyes, Kelly Margarita; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que normalmente se expresa en altos niveles en el tejido adiposo y cataliza la conversión de ácido lisofosfatídico (LPA) a ácido fosfatídico (PA), un paso fundamental en la biosíntesis de triglicéridos y glicerofosfolípidos. Mutaciones que inactivan el gen AGPAT2 causan reducción severa del tejido adiposo, tanto en seres humanos como en ratones, generando una condición patológica conocida como lipodistrofia generalizada. Los mecanismos por los cuales la deficiencia de AGPAT2 causa lipodistrofia son desconocidos. La hipótesis de este trabajo es que la falta de AGPAT2 altera el proceso de diferenciación que convierte a las células precursoras adiposas (preadipocitos) en adipocitos maduros, impidiendo, por lo tanto, la formación y expansión de tejido adiposo en los ratones Agpat2-/-. Para probar esta hipótesis se utilizó un enfoque experimental combinado, in vitro e in vivo. Estudios de adipogénesis in vitro con fibroblastos de embriones de ratón (FERs) reveló que la diferenciación adipogénica es anormal en múltiples niveles en los FERs Agpat2-/-.En primer lugar, la inducción adipogénica resultó en una alta proporción de FERs Agpat2-/- que mueren durante el proceso de expansión clonal mitótica (34 % frente a 6 % en los controles). Esto se tradujo en una proporción significativamente menor de células que progresaron a fases adipogénicas avanzadas y se correlacionó con una reducida activación de la vía de señalización de insulina. En segundo lugar, los FERs Agpat2-/- que lograron diferenciarse presentaron menor tamaño celular, menor contenido de lípidos neutros y gotas lipídicas pequeñas y desorganizadas, las cuales contienen una menor cantidad de Perilipina asociada a su superficie. Además, se observó presencia de múltiples agregados intracelulares de Perilipina no asociada a gotas lipídicas. El análisis de fetos en la última etapa de desarrollo intra uterino y de ratones recién nacidos reveló, inesperadamente, que tanto la masa total de tejido adiposo como su estructura tisular fue normal en estas etapas del desarrollo en ratones Agpat2-/-. Sin embargo, al segundo día después del nacimiento el tejido adiposo de los ratones Agpat2-/- fue rapidamente reemplazado por una elevada proporción de adipocitos en proceso de muerte celular, seguido por una masiva respuesta inflamatoria mediada por macrófagos. Finalmente, al sexto día después del nacimiento, el tejido adiposo fue indetectable en estos ratones, estableciendo un generalizado sindrome lipodistrofico. En resumen, los hallazgos de esta tesis demuestran que AGPAT2 es absolutamente necesaria para la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de los FER, así como para el crecimiento y viabilidad del tejido adiposo en la vida postnatal del ratón.